應(yīng) 翔， 金筱筱， 張紫娟， 王 凱， 丁陳靜， 鄭靈芝

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院產(chǎn)科， 浙江 臺(tái)州 317000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)的發(fā)病率在全部妊娠中占1%～5%，嚴(yán)重危害女性生育健康，其中，將近50%的患者病因不明，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。妊娠的成功有賴于滋養(yǎng)細(xì)胞功能正常和母胎免疫耐受平衡。目前研究表明，破壞滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為參與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生[1]。巨噬細(xì)胞構(gòu)成母胎免疫耐受微環(huán)境[2]，而其參與URSA的機(jī)制尚未闡明。新近研究表明，外泌體內(nèi)富含蛋白、核酸和脂質(zhì)等生物活性分子，參與母胎間交流[3]。本研究擬探討蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移功能的調(diào)節(jié)作用，為URSA發(fā)病機(jī)制研究提供新思路。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1材料來源 收集2017年2月～2019年1月在浙江省臺(tái)州醫(yī)院就診的URSA患者(URSA組)及正常早孕人工流產(chǎn)婦女[正常對(duì)照，(normal control, NC)組]的蛻膜組織。URSA組選擇自然流產(chǎn)2次及以上的患者，年齡在25～35歲之間，B超提示胚胎停止發(fā)育，且排除絨毛染色體異常和夫妻雙方外周血染色體核型異常、甲狀腺功能異常、糖尿病、性激素異常、生殖道畸形、凝血功能異常、生殖道感染、免疫紊亂、子宮動(dòng)脈血流異常和男方精液異常等因素所致的流產(chǎn)。正常組選擇年齡25～35歲，既往無不良孕產(chǎn)史，B超提示胚胎發(fā)育正常的早孕人工流產(chǎn)婦女。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 外泌體分離試劑盒購(gòu)自 Invitrogen； 抗CD63抗體購(gòu)自Abcam；PKH67染色劑購(gòu)自Sigma；MTS染色劑購(gòu)自Promega；鈣黃綠素 AM 染料購(gòu)自Invitrogen；CD14 細(xì)胞磁珠分離試劑盒購(gòu)自Miltenyi Biotec。

1.3細(xì)胞系 滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/Snveo由上海第一婦嬰保健院中心實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

2 方法

2.1蛻膜巨噬細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng) 收集正常早孕婦女及URSA患者流產(chǎn)后的蛻膜組織，置于DMEM/F12培養(yǎng)液中，30 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，予PBS漂洗干凈后剪碎、研磨、過濾，制成細(xì)胞懸液。Ficoll密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠法分選CD14+細(xì)胞即為蛻膜巨噬細(xì)胞，洗滌后加入含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含 100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)，置于37.5 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2組均取5×105個(gè)巨噬細(xì)胞。本研究經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且取得患者的知情同意。

2.2蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體的制備 收集正常早孕婦女及URSA患者蛻膜CD14+巨噬細(xì)胞培養(yǎng)1 d后的上清，2 000 r/min離心30 min去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片，轉(zhuǎn)移離心后細(xì)胞上清至新的離心管，加入細(xì)胞上清的外泌體提取試劑，按照試劑說明書要求分離獲得蛻膜巨噬細(xì)胞的外泌體，BCA蛋白定量法檢測(cè)外泌體濃度。

2.3蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體的鑒定 分離蛻膜CD14+巨噬細(xì)胞的外泌體，透射電鏡觀察巨噬細(xì)胞外泌體的大小和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。Western blot法檢測(cè)巨噬細(xì)胞外泌體的外泌體標(biāo)志蛋白CD63的表達(dá)水平。

2.4蛻膜巨噬細(xì)胞與HTR8/Snveo滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR8/Snveo細(xì)胞，按每孔 5×105鋪于含5% 胎牛血清的DMEM/F12的6 孔板中。正常早孕人工流產(chǎn)和URSA蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體以100 mg/L的濃度與HTR8/Snveo細(xì)胞共培養(yǎng)。

2.5HTR8/Snveo細(xì)胞攝取外泌體的示蹤實(shí)驗(yàn) 將HTR8/Snveo細(xì)胞按每孔5 × 105個(gè)接種于6孔板。將染色劑 PKH67 加入巨噬細(xì)胞外泌體中，室溫孵育 5 min，加入1 mL 含 1% 牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基終止標(biāo)記反應(yīng)。在混合物中加入20 mL PBS，4 ℃、100 000×g離心2 h，重復(fù)2次。用2 mL培養(yǎng)基重懸，加入HTR8/Snveo細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 37 ℃ 培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡觀察樣本。

2.6MTS法檢測(cè)共培養(yǎng)后HTR8/Snveo滋養(yǎng)細(xì)胞的活力 建立蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體和滋養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，將共培養(yǎng)后的HTR8/Snveo細(xì)胞按每孔2×103個(gè)接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。共培養(yǎng)1 d、2 d和3 d后，每孔加入20 μL的MTS染色劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7Transwell法檢測(cè)共培養(yǎng)后HTR8/Snveo滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移能力 選用8 μm孔徑的Transwell板檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。將HTR8/Snveo細(xì)胞按每孔5×104個(gè)接種于 Transwell的專用孔板中，上室加200 μL含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，下室加正常早孕人工流產(chǎn)或URSA蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體。24 h后對(duì)下室細(xì)胞使用鈣黃綠素 AM 染料染色，熒光顯微鏡觀察并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每孔取6個(gè)視野計(jì)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體的鑒定

透射電子顯微鏡下顯示，外泌體近似圓形，直徑40～80 nm，見圖1A；Western blot法結(jié)果表明，蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體高表達(dá)CD63，見圖1B。

Figure 1. Representative transmission electron microscopy micrograph of exosomes derived from decidual macrophages (A) and immunoblot of CD63 in exosomes derived from decidual macrophages (B).

圖1 蛻膜巨噬細(xì)胞電鏡圖及外泌體標(biāo)志蛋白CD63在蛻膜巨噬細(xì)胞及蛻膜巨噬細(xì)胞來源外泌體中的表達(dá)水平

2 巨噬細(xì)胞外泌體可被滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/Snveo攝取

PKH67染色巨噬細(xì)胞外泌體，將其與滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/Snveo共培養(yǎng)，熒光顯微鏡顯示HTR8/Snveo胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)熒光，見圖2，表明外泌體可被滋養(yǎng)細(xì)胞攝取。

Figure 2. Unlabeled HTR8/Snveo cells were incubated with decidual macrophage-derived exosomes that were labeled with PKH67. Data exhibits typical image of 3 independent experiments.

圖2 外泌體被滋養(yǎng)細(xì)胞攝取

3 URSA蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體抑制滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/Snveo的活力

將蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體和HTR8/Snveo 共培養(yǎng)，MTS法檢測(cè)結(jié)果顯示，同正常早孕人工流產(chǎn)蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體組比較，共培養(yǎng)2 d和3 d后URSA蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體組HTR8/Snveo細(xì)胞的活力明顯下降(P<0.05)，見圖3。這表明URSA蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體能夠抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的活力。

4 URSA蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移能力

Transwell實(shí)驗(yàn)表明，URSA蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體組的HTR8/Snveo細(xì)胞遷移數(shù)較正常早孕人工流產(chǎn)蛻膜巨噬細(xì)胞組下降(P<0.01)， 見圖4。這提示URSA蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移能力。

Figure 3.Cell viabitility of HTR8/Snveo cells which incubated with the supernatants of decidual macrophage-derived exosomes from normal pregnant induced abortion women or URSA women was detected by MTS assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsURSA macrophage-exosomes group.

圖3 蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞 HTR8/Snveo的細(xì)胞活力的影響

討 論

目前，URSA病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚。正常妊娠的建立維持需要母胎免疫耐受微環(huán)境的建立和滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)功能有序可控地進(jìn)行。母胎界面的細(xì)胞大致由胎兒來源的滋養(yǎng)細(xì)胞和母體來源的蛻膜免疫活性細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞構(gòu)成。研究表明，滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的破壞可引起流產(chǎn)等病理性妊娠的發(fā)生[1, 4]。本研究選用的滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/Snveo的生物學(xué)行為接近原代滋養(yǎng)細(xì)胞，被廣泛應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的研究。

母胎免疫耐受失衡可引起母體對(duì)胎兒的免疫排斥，臨床上表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胎兒發(fā)育受限等病理性妊娠[5]，其中，蛻膜的免疫活性細(xì)胞群由NK細(xì)胞、T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成，是母胎免疫耐受形成的基礎(chǔ)。子宮內(nèi)的巨噬細(xì)胞具有吞噬、抗原遞呈、分泌細(xì)胞因子等作用，占妊娠期間免疫職能細(xì)胞的20%～30%，在母胎界面穩(wěn)態(tài)的建立及維持中扮演重要角色[2, 6]。然而，蛻膜巨噬細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞之間的相互作用參與妊娠的具體機(jī)制尚未明了。

外泌體可存在于母胎界面，作為母胎間信息交流的載體[7]，在妊娠維持、子癇前期、妊娠期糖尿病等正常及病理妊娠中發(fā)揮相應(yīng)作用。有研究報(bào)道，巨噬細(xì)胞通過外泌體影響胎盤細(xì)胞因子的產(chǎn)生[8]。此外，外泌體可存在于母體的外周血中，有望成為病理性妊娠診斷的生物新標(biāo)記[9-10]。近年來，很多研究表明，外泌體被靶細(xì)胞內(nèi)吞后，可將其內(nèi)容物傳遞給靶細(xì)胞并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)活性[11]。本研究結(jié)果證實(shí)，蛻膜巨噬細(xì)胞的外泌體可被滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)吞。分離正常早孕人工流產(chǎn)和URSA的蛻膜巨噬細(xì)胞的外泌體，分別同滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/Snveo細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)URSA蛻膜巨噬細(xì)胞的外泌體抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的活力和遷移能力。由此提示蛻膜巨噬細(xì)胞可通過外泌體調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為，造成胚胎停止發(fā)育，參與URSA的發(fā)生。

Figure 4.Migration capacity of HTR8/Snveo cells which incubated with the decidual macrophage-derived exosomes from normal pregnant induced abortion women or URSA women was detected by Transwell assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC macrophage-exosomes group.

圖4 蛻膜巨噬細(xì)胞外泌體對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞 HTR8/Snveo遷移能力的影響

本研究為針對(duì)URSA的巨噬細(xì)胞靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，今后的研究重點(diǎn)是進(jìn)一步探討外泌體調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的分子機(jī)制并探索URSA血清分離的外泌體情況及內(nèi)容物，為URSA早期診治開辟新思路。