金晶晶， 樓佳琪， 王 脈， 陳曉斌， 楊子鍵， 黃君瑤， 張 云

(紹興文理學院醫(yī)學院， 浙江 紹興 312000)

新近假體翻修術回顧性研究發(fā)現(xiàn)，關節(jié)假體植入體內后，經過長期磨損、碰撞產生大量的聚乙烯(polyethylene，PE)、金屬鈦(titanium，Ti)和陶瓷磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)等磨損顆粒，這些顆?？杉せ罴袤w周圍巨噬細胞、成纖維細胞和成骨細胞等組織細胞釋放炎癥因子，后者誘導破骨細胞分化和存活，導致假體周圍骨溶解及關節(jié)假體松動[1-2]。假體周圍除了含有上述組織細胞外，還存在著豐富的骨細胞，其數(shù)量占骨組織細胞的90%～95%。以往研究和我們前期實驗結果表明磨損顆?？烧T導骨細胞氧化損傷[3-5]，釋放白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18等促炎癥因子，促進假體周圍骨溶解，且抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)可明顯阻止TCP磨損顆粒誘導的骨細胞死亡[6]，表明氧化應激在磨損顆粒誘導的骨細胞損傷中發(fā)揮重要作用。因此，抑制氧化應激可減少磨損顆粒誘導的骨細胞損傷及假體周圍骨溶解。

原花青素(procyanidins，PC)是從葡萄皮、葡萄籽和綠茶等植物中提取分離出的一種天然多酚類化合物，具有極強的抗氧化活性，可清除活性氧和自由基，抑制體內氧自由基的生成及脂質過氧化反應[7-9]。邵玲巧等[10]報道原花青素可清除H2O2誘導的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產生，抑制成骨細胞氧化損傷而發(fā)揮抗骨質疏松作用。但是，對于原花青素對磨損顆粒誘導的骨細胞氧化損傷的影響如何，目前尚不明確。本研究在TCP磨損顆粒誘導骨細胞MLO-Y4的氧化損傷基礎上，研究原花青素對TCP磨損顆粒誘導的骨細胞氧化損傷的影響，并闡明其可能作用機制，為原花青素用于防治假體周圍骨溶解和關節(jié)松動提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

TCP磨損顆粒由浙江大學化學系饋贈；鱟試劑購自上海吳昊經貿有限公司；原花青素購自上海源葉生物科技有限公司；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和小牛血清(calf serum，CS)購自Gibco；Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒及超敏ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術有限公司；Calcein-AM活體分子探針、MTT、RIPA裂解液、超氧化物歧化酶 (super-oxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑有限公司；兔抗NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)抗體、抗含CARD的凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)抗體、抗IL-1β抗體、抗cleaved caspase-1抗體和小鼠抗β-actin抗體購自Cell Signaling Technology；PVDF膜購自Millipore。

2 細胞株

小鼠長骨骨細胞MLO-Y4由美國密蘇里大學口腔學院Bonewald教授饋贈。MLO-Y4細胞置于含2.5% FBS和 2.5% CS的高α-MEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下進行常規(guī)培養(yǎng)。

3 主要方法

3.1骨細胞MLO-Y4的培養(yǎng) MLO-Y4加入含2.5%FBS和2.5%CS的α-MEM培養(yǎng)基中進行常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行消化傳代用于以下實驗。

3.2Calcein-AM染色 骨細胞(每孔5×103)接種于打孔皿中常規(guī)培養(yǎng)24 h，采用原花青素(10 μmol/L和50 μmol/L)預孵育4 h后，加入TCP顆粒(0.1 g/L)分別繼續(xù)孵育48 h。去除上清液后與活體分子探針Calcein-AM(5 μmol/L)孵育30 min，清洗后加入PBS置于激光共聚焦下觀察骨細胞形態(tài)的變化。

3.3MTT法檢測細胞活力 骨細胞(每孔5×103)接種于96孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)24 h，采用原花青素(10 μmol/L和50 μmol/L)預孵育4 h后，加入TCP顆粒(0.1 g/L)分別繼續(xù)孵育48 h。然后加入MTT(5 g/L)溫室避光孵育4 h；棄上清液后，加入二甲基亞砜(DMSO，200 μL)溶解甲臜；充分振搖后，置于酶標儀測定A490和A690，計算骨細胞活力的變化。

3.4流式細胞術檢測細胞凋亡 骨細胞(每孔3×104)接種于24孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)24 h，采用原花青素(10 μmol/L和50 μmol/L)預孵育4 h后，加入TCP顆粒(0.1 g/L)分別繼續(xù)孵育48 h。通過消化獲取骨細胞，經1 000 r/min離心10 min去除培養(yǎng)基，PBS清洗2次。 然后加入5 μL annexin V-FITC，10 μL PI，輕輕混勻，黑暗中室溫37 ℃溫育15 min。最后加入200 μL PBS并混勻，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。FITC的激發(fā)波長為488 nm, 檢測發(fā)射波長575 nm(Ex: 488 nm，Em: 575 nm)。

3.5ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中牙本質基質蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP-1)、骨硬化蛋白(sclerostin，SOST)和IL-1β的水平 骨細胞(每孔3×104)接種于24孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)24 h，采用原花青素(10 μmol/L和50 μmol/L)預孵育4 h后，加入TCP顆粒(0.1 g/L)分別繼續(xù)孵育48 h。取上清液利用DMP-1、SOST和IL-1β等ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中DMP-1、SOST和IL-1β水平。

3.6化學比色法檢測細胞中MDA含量和SOD活性及上清液中LDH的水平 骨細胞(每孔1.5×105)接種于6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)24 h，采用原花青素(10 μmol/L和50 μmol/L)預孵育4 h后，加入TCP顆粒(0.1 g/L)分別繼續(xù)孵育48 h，收集細胞和上清液。利用MDA、SOD和LDH試劑盒檢測骨細胞中MDA含量和SOD活性以及上清液中LDH水平的變化。

3.7Western blot檢測蛋白表達[11]骨細胞蛋白提取液加入上樣緩沖液后煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30 μg蛋白，行12%SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉移到PVDF膜上，經5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔抗NLRP3抗體(1∶1 000)、兔抗ASC抗體(1∶1 000)、兔抗IL-1β抗體(1∶1 000)、兔抗cleaved caspase-1抗體(1∶1 000)和小鼠抗β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標記的 II 抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q法分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞損傷的影響

Calcein-AM染色、MTT分析和ELISA結果顯示，與control組比較，TCP組MLO-Y4細胞受損顯著，表現(xiàn)為細胞的活力顯著降低(P<0.05)，細胞培養(yǎng)上清液中骨細胞特征蛋白DMP-1水平減少，SOST水平增加，造成DMP-1/SOST顯著降低(P<0.05)；與TCP組比較，PC(10 μmol/L 和 50 μmol/L)組骨細胞活力明顯升高，上清液中DMP-1水平明顯增加，SOST水平減少，DMP-1/SOST明顯升高(P<0.05)，見圖1、2。

Figure 1.The effect of PC on the decreased MLO-Y4 cell viability caused by TCP wear particles. A: calcein-AM staining (scale bars=20 μm); B: MTT assay. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTCP group.

圖1 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞活力降低的影響

2 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞凋亡的影響

Annexin-V/PI染色經流式細胞術定量檢測結果顯示，與control組比較，TCP組MLO-Y4細胞發(fā)生明顯凋亡，凋亡率為control組的7.60倍(P<0.05)；與TCP組比較，PC組骨細胞凋亡顯著減少，其凋亡率分別減少為TCP組的74.15%(10 μmol/L)和24.08%(50 μmol/L)(P<0.05)，見圖3。

3 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞氧化應激的影響

與control組比較，TCP組骨細胞發(fā)生氧化應激，表現(xiàn)為骨細胞中MDA含量明顯增加，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與TCP組比較，PC組骨細胞中MDA顯著降低，SOD活性明顯增加(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.The effect of PC on dysfunction of the MLO-Y4 cells induced by TCP wear particles. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTCP group.

圖2 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞功能損傷影響

Figure 3.The effect of PC on the apoptosis of MLO-Y4 cells induced by TCP wear particles. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTCP group.

圖3 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞凋亡的影響

Figure 4.The effect of PC on oxidative stress in MLO-Y4 cells induced by TCP wear particles. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTCP group.

圖4 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞氧化應激的影響

4 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞炎癥小體活化的影響

Western blot檢測結果顯示，與control組比較，TCP組骨細胞中炎癥小體活化，表現(xiàn)為炎癥小體成分蛋白NLRP3和ASC表達均明顯上調(P<0.05)；與TCP組比較，PC組骨細胞中NLRP3和ASC表達顯著降低(P<0.05)，且高劑量(50 μmol/L)的PC抑制骨細胞中炎癥小體活化效果更強，見圖5。

5 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞焦亡的影響

與control組比較，TCP組骨細胞中細胞焦亡標志蛋白cleaved caspase-1和成熟IL-1β的表達明顯升高，且上清液中IL-1β水平及LDH釋放也顯著增加(P<0.05)；與TCP組比較，PC劑量依賴性地抑制cleaved caspase-1和IL-1β的激活，且高劑量(50 μmol/L)的PC抑制骨細胞焦亡作用較強，見圖6。

討 論

以往研究和本實驗結果顯示TCP磨損顆?？烧T導骨細胞MLO-Y4氧化損傷，主要表現(xiàn)為骨細胞活性顯著降低、細胞凋亡顯著，MDA和ROS水平顯著增加，SOD活性明顯減少，且抗氧化劑NAC能明顯抑制上述骨細胞死亡[6]。原花青素是一種很強的自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑，其抗氧化作用遠遠強于維生素C和維生素E[7-9]，目前主要應用于抗氧化、抗炎、抗腫瘤和降血糖等方面的治療。本研究結果表明原花青素可明顯抑制TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞氧化應激反應，減少MDA含量、增加SOD活性，減輕細胞氧化損傷，其機制可能是原花青素結構中的多個酚羥基在體內被氧化釋放H+，競爭性與MLO-Y4細胞中自由基及氧化產物結合，保護脂質不被氧化，阻斷自由基鏈式反應，減弱氧化應激反應[12]。

Figure 5.The effect of PC on inflammasome activation in MLO-Y4 cells induced by TCP wear particles. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTCP group.

圖5 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞炎癥小體活化的影響

眾多研究證實ROS或氧化應激參與NLRP3炎癥小體的激活過程。NLRP3炎癥小體的激活因子細菌脂多糖可誘導ROS的生成，進一步活化氧化還原依賴的轉錄因子NF-κB和AP-1并促進IL-1β和IL-18的產生[13]。同時，體內研究結果顯示caspase-1激活和IL-1β合成以及細胞焦亡的發(fā)生也依賴于ROS產生[14]。NLRP3炎癥小體是位于細胞內的一種蛋白復合物，它包括NLRP3、ASC和caspase-1。NLRP3炎癥小體被激活后通過接頭蛋白ASC，募集半胱天冬氨酸蛋白酶1前體，進而自我催化加工形成cleaved caspase-1；活化的caspase-1能切割 IL-1β前體使其形成成熟的IL-1β并分泌至胞外，誘導細胞焦亡[15-16]。本研究中TCP磨損顆粒誘導MLO-Y4細胞發(fā)生氧化損傷后，細胞形態(tài)發(fā)生收縮、變圓、排列紊亂、細胞膜破裂等現(xiàn)象，與DiPeso等[17]所報道的細胞焦亡性死亡形態(tài)基本相似；同時細胞中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1等蛋白表達顯著上調，下游IL-1β、蛋白表達以及LDH釋放水平也明顯增加，表明TCP磨損顆?？烧T導MLO-Y4細胞中炎癥小體活化和細胞焦亡，這與骨細胞的氧化損傷趨勢基本一致。

Figure 6.The effect of PC on pyroptosis of MLO-Y4 cells induced by TCP wear particles. A: the protein expression levels of cleaved caspase-1 and IL-1β were detected by Western blot; B: the LDH release was detected by chemical colorimetry; C: the level of IL-1β in the culture media was examined by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTCP group.

圖6 PC對TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞焦亡的影響

有證據(jù)顯示ROS的清除劑或抑制劑能阻止NLRP3炎癥小體的活化[18-19]。Wang等[20]發(fā)現(xiàn)原花青素抑制NLRP3炎癥小體的活化與ROS/AP-1 通路被抑制密切相關。另有研究表明原花青素可明顯阻止阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)大鼠腦組織中NLRP3炎癥小體活化，減少海馬和皮質中促炎癥因子IL-1β和IL-6的釋放，延緩AD進程[21]。與之類似，本實驗結果顯示原花青素可明顯減弱TCP磨損顆粒誘導的MLO-Y4細胞中NLRP3炎癥小體的活化及細胞焦亡的發(fā)生，抑制骨細胞損傷。

綜上所述，原花青素可通過抑制TCP磨損顆粒誘導的NLRP3炎癥小體活化和細胞焦亡而減輕骨細胞氧化損傷。因此，原花青素有望成為防治假體周圍骨細胞損傷及骨溶解的一種潛在藥物。