劉雅林， 謝蘭蘭， 王麗云， 趙瑞杰， 許 峰， 王文勝

(河北省邢臺市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 河北 邢臺 054000)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是老年性癡呆癥中最常見的一種神經(jīng)退行性疾病，臨床上常見的病理表現(xiàn)主要有記憶力下降、執(zhí)行功能障礙和行為改變等[1-2]。隨著我國老齡化的加劇，AD的發(fā)病率有明顯升高的趨勢，嚴重影響著人們的生活質(zhì)量，因此，AD的改善和治療已成為我國亟待解決的社會問題。隨著醫(yī)學領域發(fā)展，盡管在AD的發(fā)病機制和治療藥物的研究等方面有所突破，但仍然缺乏特異性的治療藥物與方法，AD的防治仍是醫(yī)學界面臨的重大難題。海馬是神經(jīng)系統(tǒng)中與學習記憶通路關(guān)系密切相關(guān)的大腦組織，海馬神經(jīng)元的凋亡被認為是導致學習記憶功能障礙的重要因素[3-4],因此，如何減少海馬神經(jīng)元的凋亡以改善AD的認知能力可能是防治AD的策略。

丁苯酞(butylphthalidle，NBP)是一種臨床上治療輕、中度急性缺血性腦卒中等疾病的常用藥，具有改善腦部供血、抗腦血栓形成、拮抗自由基損傷及抑制神經(jīng)元凋亡的作用[5-6]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是sirtuins去乙?；讣易宄蓡T，可通過使底物去乙?；瘡亩{(diào)控基因的表達，參與細胞凋亡與衰老、炎癥反應和氧化應激等過程。研究證實[7-8]，SIRT1可通過去乙?；饔眯揎桼elA/P65的殘基抑制核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的活性，從而減少神經(jīng)元凋亡，在神經(jīng)保護過程中發(fā)揮著重要作用。有研究指出[9]，丁苯酞可通過上調(diào)Bcl-2，并下調(diào)Bax和caspase-3蛋白的表達抑制海馬神經(jīng)元凋亡，但其有無介導SIRT1/NF-κB信號通路參與這一過程并不清楚。因此，我們通過構(gòu)建AD大鼠模型，探討丁苯酞通過調(diào)控SIRT1/NF-κB信號通路對海馬神經(jīng)元凋亡的影響，以期為丁苯酞防治AD提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實驗動物 63只SPF級健康成年雄性SD大鼠(體重260～290 g)購于蘇州大學醫(yī)學院實驗動物中心，許可證號為SCXK(蘇)2018-0006。飼養(yǎng)條件：溫度27 ℃，濕度45%～65%，通風良好，自由攝食與飲水，適應性喂養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.2試劑與儀器 丁苯酞購自石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco；生理鹽水購自石家莊第四制藥廠；蘇木素和伊紅購自武漢博士德生物公司；水合氯醛購自上海化學試劑有限公司；抗Bcl-2和Bax多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；抗β肌動蛋白(β-actin)和p-NF-κB p65 單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology；抗p-NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α,IκBα)和cleaved caspase-3多克隆抗體購自Cell Signaling;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白檢測試劑盒購自上海生工有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自Invitrogen。石蠟組織切片機購自Leica；流式細胞儀購自BD;CO2細胞培養(yǎng)箱購自Forma Scientific；光學顯微鏡購自Olympus。

2 方法

2.1AD大鼠模型的制備與實驗分組 按照大鼠體重10 mL/kg的標準每天以5 mg/kg氯化鋁(AlCl3)灌胃聯(lián)合腹腔注射60 mg/kg D-半乳糖的方式構(gòu)建AD大鼠模型，給藥處理3個月。將63只SD大鼠隨機分為9組，每組7只，分別為對照(control)組：同時間給予等體積的生理鹽水灌胃；模型(model)組：上午7點以生理鹽水灌胃，下午給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；丁苯酞低劑量(low dose of NBP, NBP-L)、中劑量(middle dose of NBP, NBP-M)和高劑量(high dose of NBP, NBP-H)組：上午同時間給予25、50和100 mg/kg丁苯酞灌胃，下午同時間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；SIRT1激活劑(SRT1720)組：上午同時間給予終濃度為16 μmol/L的SIRT1激活劑SRT1720灌胃，下午同時間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；SIRT1抑制劑(sirtinol)組：上午同時間給予終濃度為80 μmol/L的SIRT1抑制劑sirtinol灌胃，下午同時間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；丁苯酞中劑量+SIRT1抑制劑(NBP-M+sirtinol)組：上午同時間給予50 mg/kg丁苯酞和終濃度為80 μmol/L的SIRT1抑制劑sirtinol灌胃，下午同時間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射；丁苯酞中劑量+ddH2O(NBP-M+ddH2O)組：上午同時間給予50 mg/kg丁苯酞和等量蒸餾水灌胃，下午同時間給予AlCl3灌胃和D-半乳糖腹腔注射。

2.2HE染色 給藥處理結(jié)束后，每組隨機選取3只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，斷頭取腦組織。參照Paxinos第3版大鼠腦解剖圖定位海馬區(qū)，取海馬區(qū)組織，以冷凍切片機制備片厚20 μm的組織冠狀切片。將制備的海馬區(qū)組織切片浸泡于二甲苯中10 min后，更換二甲苯再浸泡10 min，再依次分別置于濃度為100%、 95%、90%、80%和70%的乙醇中浸泡10 min。經(jīng)蒸餾水洗滌后，以蘇木素染色1 min，1%鹽酸分化10 s和伊紅染色2 min;再依次經(jīng)70%、80%、90%和95%梯度的乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片。采用光學顯微鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)及密度。

2.3流式細胞儀檢測 取海馬組織，以0.25%胰蛋白酶消化，并以DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)終止消化，以12 000×g離心10 min收集細胞后，采用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞。以結(jié)合緩沖液重懸細胞，再參照細胞凋亡檢測試劑盒說明書按步驟分別加入異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙啶，避光條件下充分混勻后，上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

2.4Western blot檢測 取海馬組織，研磨成漿后，加入細胞裂解液提取總蛋白，并參照BCA蛋白定量試劑盒對總蛋白進行定量。調(diào)整上樣蛋白濃度為50 μg，加入等量的2×上樣緩沖液，經(jīng)沸水浴變性5 min后，行SDS-PAGE。電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上后，浸泡于含5%脫脂奶粉的封閉液中常溫孵育1 h。再分別與封閉液稀釋的特異性Ⅰ抗(1∶1 000)室溫孵育3 h，辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。經(jīng)封閉液洗膜后，以化學發(fā)光劑顯色曝光，分別以SigmaScan Pro 5軟件采集圖像，以β-actin為內(nèi)參照，GraphPad Prism 5軟件分析目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 丁苯酞改善AD大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)

對照組大鼠海馬神經(jīng)元排列緊密整齊，層次清楚，神經(jīng)元核呈圓形，形態(tài)正常；模型組大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂，可見疏松區(qū)，神經(jīng)元核固縮，小膠質(zhì)細胞明顯增生；與模型組相比，丁苯酞低、中和高劑量組海馬組織病理變化有明顯改善，神經(jīng)元排列較有序，部分神經(jīng)元核呈圓形，數(shù)目明顯增多，見圖1。

Figure 1.The morphology of hippocampal neurons of rats in each group was observed by HE staining. The scale bar=50 μm.

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元HE染色結(jié)果

2 丁苯酞抑制AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡

與對照組相比，模型組海馬神經(jīng)元的凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平均顯著升高，而Bcl-2蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中和高劑量組海馬神經(jīng)元的凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平均顯著降低，而Bcl-2蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)；且丁苯酞中、高劑量組的作用顯著大于低劑量組(P<0.05)，而丁苯酞中、高劑量組間的作用無顯著差異(P>0.05),見圖2。

3 丁苯酞對SIRT1/NF-κB信號通路的影響

Western blot進一步檢測海馬組織中SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白SIRT1、p-NF-κB p65和p-IκBα的表達情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組中SIRT1蛋白表達顯著降低，而p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達顯著升高(P<0.05)；丁苯酞低、中和高劑量組中SIRT1蛋白表達較模型組顯著升高，而p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達顯著低于模型組(P<0.05)，見圖3。

4 激活SIRT1/NF-κB信號通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡

與模型組相比，給予SIRT1激動劑SRT1720處理后，SIRT1表達顯著升高，而p-NF-κB p65和p-IκBα的表達顯著降低(P<0.05);SRT1720組細胞凋亡率較模型組顯著降低(P<0.05)；SRT1720組細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著高于模型組，而Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著低于模型組(P<0.05)，見圖4。

Figure 2.Effect of butylphthalide (NBP) on apoptosis of hippocampal neurons in AD rats. A：the apoptosis rate of each group was detected by flow cytometry; B：the protein expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vsNBP-L group.

圖2 丁苯酞對AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

Figure 3.Effect of butylphthalide (NBP) on the expression of SIRT1/NF-κB signaling pathway related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vsNBP-L group.

圖3 丁苯酞對SIRT1/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

5 抑制SIRT1/NF-κB信號通路促進海馬神經(jīng)元凋亡

與模型組相比，給予SIRT1抑制劑sirtinol處理的大鼠海馬組織中SIRT1和Bcl-2蛋白表達顯著降低，而p-NF-κB p65、p-IκBα、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達水平及細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖5。

6 丁苯酞通過調(diào)控SIRT1/NF-κB信號通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡

與模型組相比，給予50 mg/kg丁苯酞處理后，細胞凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平顯著降低，而Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；而給予SIRT1抑制劑sirtinol處理后，丁苯酞對海馬神經(jīng)元凋亡和Bax、cleaved caspase-3蛋白表達的抑制作用及對Bcl-2蛋白表達的促進作用均顯著減弱(P<0.05)，見圖6。

討 論

丁苯酞具有較好的神經(jīng)保護作用，其可通過激活Nrf2-ARE途徑增加抗氧化酶活性并減輕神經(jīng)功能缺損、腦含水量和皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡引起的腦損傷[10]；通過激活Akt/mTOR信號抑制神經(jīng)元凋亡和自噬，改善反復腦缺血再灌注損傷小鼠的認知損傷[11]，還可通過p38 MAPK通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡進而改善血管性癡呆大鼠的學習記憶能力[12]。SIRT1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；福瑥V泛表達于成熟組織中，可通過去乙酰化作用調(diào)控基因表達，在抗炎、抗氧化應激和抗凋亡等生理病理過程中發(fā)揮著重要作用[13-15]。在AD病變過程中，SIRT1可通過抑制NF-κB信號通路或增強α-分泌酶的活性減少β-淀粉樣蛋白的病理沉積；其激活可改善腦室注射鏈脲酶素導致的海馬區(qū)認知障礙，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，被認為是預防和改善AD的重要靶基因[16]。研究證實[7,9,17]，丁苯酞可通過上調(diào)Bcl-2，并下調(diào)Bax和caspase-3的表達抑制AD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡；SIRT1可通過抑制NF-κB活性減少神經(jīng)元凋亡，丁苯酞可通過上調(diào)SIRT1表達抑制海馬神經(jīng)元凋亡，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷；但丁苯酞是否通過激活SIRT1/NF-κB途徑發(fā)揮抑制海馬神經(jīng)元凋亡進而改善AD神經(jīng)損傷尚需充分認識。

Figure 4.Effect of activation of SIRT1/NF-κB signaling pathway on apoptosis of hippocampal neurons. A: the protein expression of SIRT1, p-NF-κB p65 and p-IκBα was detected by Westem blot; B: the apoptosis rate was detected by flow cytometry; C: the protein expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4 激活SIRT1/NF-κB信號通路對海馬神經(jīng)元凋亡的影響

Figure 5.Effects of inhibiting SIRT1/NF-κB signaling pathway on apoptosis of hippocampal neurons. A: the protein expression of SIRT1, p-NF-κB p65 and p-IκBα was detected by Westem blot; B: the apoptosis rate was detected by flow cytometry; C:the protein expression of Bcl-2, Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖5 抑制SIRT1/NF-κB信號通路對海馬神經(jīng)元凋亡的影響

Figure 6.Effects of butylphthalide (NBP) on apoptosis of hippocampal neurons regulated by SIRT1/NF-κB signaling pathway. A: the apoptosis rate was detected by flow cytometry; B: the protein expression of Bcl-2,Bax and cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group;&P<0.05vsNBP-M+ddH2O group.

圖6 丁苯酞調(diào)控SIRT1/NF-κB信號通路對海馬神經(jīng)元凋亡的影響

腹腔注射D-半乳糖聯(lián)合AlCl3灌胃是構(gòu)建AD大鼠模型常用方法[18-20]。我們采用上述方法造模并給予丁苯酞作用后，HE染色檢測模型組神經(jīng)元較對照組出現(xiàn)了嚴重缺失和核固縮等病理改變；而給予丁苯酞處理的大鼠海馬組織中神經(jīng)元的病理變化較模型組有顯著改善；流式細胞術(shù)和Western blot檢測到丁苯酞可抑制AD大鼠模型中海馬神經(jīng)元凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達，而上調(diào)Bcl-2的表達，這一結(jié)果與文獻報道的結(jié)果相吻合[9]。Western blot進一步檢測丁苯酞可上調(diào)AD大鼠模型中SIRT1蛋白表達，下調(diào)p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表達，提示SIRT1/NF-κB信號通路在丁苯酞改善AD神經(jīng)損傷過程中發(fā)揮著重要作用。以SIRT1激活劑SRT1720上調(diào)SIRT1表達并抑制NF-κB活性后，觀察到海馬神經(jīng)元的凋亡率顯著降低，同時Bax和cleaved caspase-3表達受到抑制，而Bcl-2表達增強；而以SIRT1抑制劑sirtinol作用后得到與之相反的結(jié)果，這一結(jié)果與研究報道的上調(diào)SIRT1表達可通過上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax表達及caspase-3活性抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的機制相一致[21]。同時觀察到sirtinol可顯著減弱丁苯酞對海馬神經(jīng)元凋亡和Bax和cleaved caspase-3蛋白表達的抑制作用,及對Bcl-2蛋白表達的促進作用，這一結(jié)果提示，丁苯酞可通過SIRT1/NF-κB途徑上調(diào)Bcl-2，并下調(diào)Bax和cleaved caspase-3蛋白表達抑制海馬神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，SIRT1/NF-κB信號通路在AD海馬神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，激活SIRT1/NF-κB信號通路,下調(diào)Bax和cleaved caspase-3,并上調(diào)Bcl-2蛋白的表達可能是丁苯酞抑制海馬神經(jīng)元凋亡的機制之一。