暴克堯， 周小慧， 孫溢澤， 馬吉英， 黨凱， 常惠， 王慧平*

(1. 西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，西安710069； 2. 西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，西安710072)

生理學(xué)是一門(mén)以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的學(xué)科，實(shí)驗(yàn)在生理學(xué)的科研和教學(xué)中有著不可替代的作用，其中教學(xué)實(shí)驗(yàn)既是教師講授生理學(xué)的重要內(nèi)容和載體，也是學(xué)生學(xué)習(xí)生理學(xué)的重要環(huán)節(jié)和手段。近年來(lái)，隨著各高校教學(xué)目標(biāo)和實(shí)驗(yàn)條件的不斷提升，對(duì)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)(在高等醫(yī)學(xué)院校里，囊括在機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)中)的教學(xué)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)方法也提出了新的要求，開(kāi)設(shè)綜合性強(qiáng)、技術(shù)性高、更能培養(yǎng)學(xué)生能力的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目成為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)(司道文等，2013；羅繼景，2014；李鵬等，2017)。

電刺激骨骼肌，觀察骨骼肌的收縮是生理學(xué)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目，包括改變電刺激強(qiáng)度觀察骨骼肌收縮張力的變化，改變電刺激頻率觀察骨骼肌收縮形式的變化等。這一系列實(shí)驗(yàn)可直觀地體現(xiàn)骨骼肌的收縮特點(diǎn)及其與刺激之間的關(guān)系，且實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)較簡(jiǎn)單，易于施行，因此在各實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教材及各高校的教學(xué)實(shí)踐中普遍存在。傳統(tǒng)骨骼肌收縮實(shí)驗(yàn)使用普通蛙類(lèi)動(dòng)物(多用物種為蛙或蟾蜍)作為實(shí)驗(yàn)材料(莫書(shū)榮，2003；裴建明，2011；欒新紅等，2012；解景田等，2016)。但普通蛙類(lèi)動(dòng)物并非標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在體質(zhì)量、肌重，甚至品種等方面存在著較大的個(gè)體差異，使得不同個(gè)體之間的結(jié)果難以對(duì)比。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中需要制備離體坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本，該標(biāo)本制作過(guò)程包括雙毀髓、股部坐骨神經(jīng)分離、脊柱縱向剪開(kāi)等步驟，這些步驟要求學(xué)生精確實(shí)施，操作失誤會(huì)使標(biāo)本受到不可逆損傷，無(wú)法用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，這對(duì)初學(xué)者有一定難度。蛙類(lèi)動(dòng)物體表的毒腺及黏液也會(huì)使初學(xué)者產(chǎn)生一定的排斥心理。蛙類(lèi)動(dòng)物的肌肉亦不能完全體現(xiàn)哺乳動(dòng)物肌肉的收縮特點(diǎn)，如哺乳動(dòng)物骨骼肌分快縮型和慢縮型，二者收縮速率不同，蛙類(lèi)動(dòng)物骨骼肌無(wú)快慢之分。另外，在各地的教學(xué)實(shí)踐中，尚有使用野生蛙類(lèi)動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的情況，長(zhǎng)期大量使用野生動(dòng)物會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)氐纳镔Y源產(chǎn)生影響，也不利于學(xué)生生態(tài)保護(hù)意識(shí)的培養(yǎng)。

針對(duì)以上使用蛙類(lèi)動(dòng)物的不足，我們?cè)岢鍪褂肧D大鼠進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)(王慧平等，2019)。但在實(shí)際教學(xué)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)抓取和麻醉大鼠對(duì)初次接觸大鼠的學(xué)生來(lái)講有一定的困難和危險(xiǎn)。另外，本教研室近年來(lái)致力于模擬失重致骨骼肌廢用性萎縮的研究，對(duì)模擬失重動(dòng)物模型的制備方法及骨骼肌的收縮功能進(jìn)行了深入研究，研究表明將大鼠體軸與地面呈30°尾部懸吊2周以上，其后肢比目魚(yú)肌(抗重力肌，SOL)可出現(xiàn)嚴(yán)重的萎縮，表現(xiàn)為肌重減少、收縮力下降、肌纖維橫截面積減小、慢縮型肌纖維向快縮型肌纖維轉(zhuǎn)化等現(xiàn)象(Duetal.，2011；馮斑等，2011；Lietal.，2012；Zhangetal.，2017；Gaoetal.，2018)。因此，我們提出在本實(shí)驗(yàn)中使用模擬失重KM小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并在實(shí)驗(yàn)中加入模擬失重小鼠與正常小鼠骨骼肌收縮功能的對(duì)比，以豐富實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募霸?/h2>

通過(guò)此實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生學(xué)習(xí)肌肉實(shí)驗(yàn)的電刺激方法及肌肉收縮的記錄方法，觀察不同刺激強(qiáng)度及刺激頻率引起的骨骼肌收縮形式的改變，同時(shí)了解模擬失重對(duì)骨骼肌收縮功能的影響。實(shí)驗(yàn)原理包括了刺激強(qiáng)度與骨骼肌收縮反應(yīng)的關(guān)系，骨骼肌收縮的總和，不同刺激頻率引起的骨骼肌收縮形式的改變，及模擬失重致骨骼肌發(fā)生廢用性萎縮時(shí)收縮功能的變化等相關(guān)生理學(xué)知識(shí)。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雌性KM小鼠隨機(jī)分為模擬失重組(SWL組)和正常對(duì)照組(CON組)，每組8只。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合西北大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 模擬失重小鼠模型制備參照Du等(2011)的方法，小鼠尾部懸吊，保持后肢懸空，前肢正?；顒?dòng)，小鼠體軸與地面呈30°，連續(xù)21 d。在此期間，小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

2.2.2 手術(shù)處理25%烏拉坦(5 mL·kg-1體質(zhì)量)腹腔注射麻醉小鼠。將小鼠側(cè)臥位固定于恒溫手術(shù)臺(tái)上，剪去一側(cè)后肢脛部外側(cè)被毛。剪開(kāi)皮膚，暴露脛部肌肉，于脛骨與腓腸肌間找到SOL。將SOL與周邊組織分離后完全暴露，避免周邊組織的附著粘連對(duì)SOL收縮過(guò)程的影響。SOL下端肌腱處穿線(xiàn)結(jié)扎，并于扎線(xiàn)下方剪斷肌腱，使其下端游離，SOL上端仍與脛部相連，SOL處于半游離狀態(tài)。

2.2.3 生理信號(hào)采集系統(tǒng)連接將扎線(xiàn)與張力換能器連接，調(diào)整張力換能器方位使SOL、扎線(xiàn)、張力換能器處于同一水平面上，SOL與扎線(xiàn)在同一直線(xiàn)上，并同張力換能器呈90°，SOL的初始長(zhǎng)度與其在體內(nèi)的自然長(zhǎng)度一致。電子刺激器的雙針式刺激電極輕置于SOL的上半部分，輸出電刺激引發(fā)SOL收縮。收縮張力信號(hào)經(jīng)張力換能器由Powerlab生理信號(hào)采集系統(tǒng)(ADInstruments，上海)采集并記錄。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不時(shí)在SOL及創(chuàng)口表面滴加K-H液(單位：mmol·L-1，NaCl 118，KCl 4.75，MgSO41.18，NaHCO324.8，KH2PO41.18，CaCl22.54，葡萄糖10，pH7.4)以保持濕潤(rùn)。

2.2.4 收縮活動(dòng)記錄單收縮：手動(dòng)發(fā)出刺激，刺激幅度從0 V開(kāi)始，逐漸增大刺激強(qiáng)度，每次刺激間隔大于10 s，以避免頻繁刺激引起肌肉疲勞。觀察收縮張力曲線(xiàn)變化，直至出現(xiàn)最大收縮張力曲線(xiàn)。利用信號(hào)采集系統(tǒng)配套軟件Chart 5.0在最大收縮張力曲線(xiàn)上測(cè)量以下單收縮的功能指標(biāo)：?jiǎn)问湛s最大張力(P0)、從收縮開(kāi)始達(dá)到最大張力所需時(shí)間(TPT)、從舒張開(kāi)始至舒張結(jié)束所需時(shí)間(RT)和單收縮所做的功，為單收縮張力曲線(xiàn)與橫軸所圍成的面積，即積分(P0-Output)。強(qiáng)直收縮：固定一個(gè)閾上刺激強(qiáng)度，以一個(gè)較低的刺激頻率連續(xù)刺激肌肉，出現(xiàn)連續(xù)的多個(gè)單收縮曲線(xiàn)。逐漸增大刺激頻率，單收縮逐漸融合，出現(xiàn)不完全強(qiáng)直收縮曲線(xiàn)。繼續(xù)增大刺激頻率直至出現(xiàn)完全強(qiáng)直收縮曲線(xiàn)。疲勞性：固定一個(gè)能引發(fā)正常對(duì)照小鼠與模擬失重小鼠的SOL均發(fā)生完全強(qiáng)直收縮的閾上刺激強(qiáng)度和刺激頻率(通過(guò)實(shí)踐，刺激強(qiáng)度設(shè)為3 V，刺激頻率設(shè)為 50 Hz)，持續(xù)刺激5 s為一次，連續(xù)刺激12次，每次中間停歇5 s，得到連續(xù)12個(gè)完全強(qiáng)直收縮曲線(xiàn)。在每個(gè)完全強(qiáng)直收縮曲線(xiàn)上測(cè)量Pt(完全強(qiáng)直收縮最大張力)和Pt-Output(完全強(qiáng)直收縮所做的功)。

2.3 數(shù)據(jù)分析

將各數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean±SD表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 單收縮功能分析

逐漸增加刺激強(qiáng)度，CON組與SWL組SOL的單收縮張力均逐漸增加，但CON組增加幅度大，SWL組增加幅度較小(圖1)。與CON組相比，SWL組最大單收縮的P0、P0-Output、TPT和RT均顯著減少。表明模擬失重后，SOL單收縮張力顯著降低，做功顯著減少，收縮與舒張時(shí)間明顯縮短(表1)。

圖1 比目魚(yú)肌單收縮Fig. 1 The twitch contraction of soleus muscle

A. 逐漸增加刺激強(qiáng)度引發(fā)的單收縮， B. 最大單收縮

A. the twitch contraction induced by increasing intensity stimulus， B. the maximal twitch contraction

表1 單收縮功能指標(biāo)Table 1 The contractile properties of twitch contraction

注Notes： 與對(duì)照組相比compared with CON group，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 下同the same below

3.2 肌肉收縮形式與電刺激頻率的關(guān)系

逐漸增加刺激頻率，CON組、SWL組的SOL均出現(xiàn)不完全強(qiáng)直收縮和完全強(qiáng)直收縮(圖2)。

圖2 逐漸增加刺激頻率引發(fā)的強(qiáng)直收縮Fig. 2 The tetanic contraction induced by increasing frequency stimulus

3.3 完全強(qiáng)直收縮功能分析

SWL組Pt和Pt-Output與CON組相比均顯著性減少。表明模擬失重后，SOL完全強(qiáng)直收縮的張力顯著降低，做功顯著減少(表2)。

表2 首個(gè)完全強(qiáng)直收縮功能指標(biāo)Table 2 The contractile properties of the first completetetanic contraction

3.4 疲勞性分析

隨著連續(xù)完全強(qiáng)直收縮的進(jìn)行，CON組與SWL組完全強(qiáng)直收縮張力和做功均下降，但SWL組降低的速度更快，幅度更大(圖3，圖4)。

圖3 連續(xù)完全強(qiáng)直收縮Fig. 3 The continuous complete tetanic contraction

圖4 連續(xù)完全強(qiáng)直收縮張力與做功的變化Fig. 4 The changes of tension and output in continuous complete tetanic contraction

4 結(jié)語(yǔ)

骨骼肌收縮實(shí)驗(yàn)是生理學(xué)中的傳統(tǒng)經(jīng)典教學(xué)實(shí)驗(yàn)，在各高校多年的教學(xué)實(shí)踐中，已有學(xué)者針對(duì)使用普通蛙類(lèi)動(dòng)物的不足，使用牛蛙Lithobatescatesbeiana、小鼠、SD大鼠等均能很好地完成此實(shí)驗(yàn)(劉紫荊，陳筱春，2008；沙愛(ài)龍等，2017；王慧平等，2019)。用模擬失重小鼠的SOL進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著刺激強(qiáng)度的增大，其收縮強(qiáng)度增大；隨著刺激頻率的增大，其收縮形式由一連串的單收縮逐步融合成不完全強(qiáng)直收縮，乃至完全強(qiáng)直收縮，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)原理預(yù)期完全吻合?？梢?jiàn)，使用模擬失重小鼠替代普通蛙類(lèi)動(dòng)物，亦能完成傳統(tǒng)骨骼肌收縮實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容。

使用模擬失重小鼠，在完成傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，還能觀察中長(zhǎng)期失重狀態(tài)對(duì)骨骼肌收縮功能的影響。我們讓學(xué)生同時(shí)測(cè)定模擬失重小鼠和正常小鼠的收縮功能，結(jié)果顯示，模擬失重小鼠SOL單收縮張力與做功能力降低，收縮與舒張時(shí)間均快于正常小鼠，完全強(qiáng)直收縮張力與做功能力減弱，肌肉抗疲勞能力下降，在連續(xù)收縮過(guò)程中更易疲勞。這些結(jié)果與我們的科研結(jié)果一致，體現(xiàn)了骨骼肌在長(zhǎng)期模擬失重狀態(tài)下發(fā)生了一定程度的萎縮，從而導(dǎo)致收縮功能下降。通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，就可以向?qū)W生直接展示失重狀態(tài)對(duì)骨骼肌收縮功能的影響，在傳統(tǒng)骨骼肌收縮實(shí)驗(yàn)中引入了航天生理學(xué)的研究方法，增加了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，使學(xué)生對(duì)航天生理學(xué)有了一個(gè)初步的了解。目前，我國(guó)載人航天事業(yè)正在蓬勃發(fā)展，在生理學(xué)教學(xué)中適機(jī)加入航天生理學(xué)的內(nèi)容，不但能拓寬學(xué)生的知識(shí)領(lǐng)域，更能激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)本課程的興趣，激發(fā)學(xué)生的愛(ài)國(guó)情懷。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，SOL或機(jī)體的其他組織器官還可用于其他實(shí)驗(yàn)，可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物得到充分利用，節(jié)約實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，提高教學(xué)投入效益。

本實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易行，所用動(dòng)物為常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心均可提供。除小鼠吊尾外，其余均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。小鼠吊尾方法可參照文獻(xiàn)進(jìn)行(Morey-Holton & Ruth，2002；Duetal.，2011；林煜等，2012)。2018年，將這一新的教學(xué)實(shí)驗(yàn)引入我校本科生理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，約150名學(xué)生分組進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn)，共測(cè)定了20只正常小鼠和20只模擬失重小鼠SOL的收縮功能。實(shí)驗(yàn)總體成功率84%，平均耗時(shí)3 h。此次實(shí)踐表明本實(shí)驗(yàn)適合作為教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。經(jīng)過(guò)實(shí)踐，我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有兩點(diǎn)需要注意：第一，多數(shù)學(xué)生實(shí)驗(yàn)前不知道SOL的解剖位置。我們運(yùn)用解剖圖譜和事先拍好的照片，明確清晰地展示了SOL的具體位置，有助于學(xué)生在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)迅速準(zhǔn)確確定SOL。第二，小鼠的體質(zhì)量較輕，實(shí)驗(yàn)中可以在小鼠身上放置1、2把手術(shù)器械，如剪刀、止血鉗等，這樣的增重可以使SOL近心端更易固定，以免收縮時(shí)近心端移動(dòng)影響張力數(shù)值。

目前國(guó)內(nèi)流行的生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教材，其內(nèi)容多是經(jīng)典傳統(tǒng)的生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。雖然這些實(shí)驗(yàn)在幾十年的教學(xué)實(shí)踐中已被證明其理論原理清晰、步驟設(shè)計(jì)合理、結(jié)果直觀可靠，但在當(dāng)今，卻顯得內(nèi)容相對(duì)陳舊、缺乏時(shí)代氣息，與現(xiàn)代生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)的發(fā)展相距甚遠(yuǎn)，不能很好地調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣和積極性。大多數(shù)高校教師都承擔(dān)有科研任務(wù)，擁有一定的科研技術(shù)和成果。如能將自身的科研技術(shù)或成果與實(shí)驗(yàn)教學(xué)結(jié)合起來(lái)，將可極大提升實(shí)驗(yàn)教學(xué)的前沿性和挑戰(zhàn)性，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，這也是目前教學(xué)改革提倡的方式之一(卜遲武等，2010；房偉等，2013；林躍強(qiáng)等，2015；趙永軍等，2016；周智華等，2017)。本實(shí)驗(yàn)將科研中模擬失重動(dòng)物骨骼肌收縮功能的測(cè)定方法和結(jié)果引入教學(xué)，從而豐富了傳統(tǒng)骨骼肌收縮實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容，提升了實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平，在實(shí)踐中收到了良好的教學(xué)效果。