肖寧， 羅慶華， 羅濤， 魏芳， 曾亞軍

(1.貴陽護(hù)理職業(yè)學(xué)院，貴陽550081； 2. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽550001；3.荔波縣世界自然遺產(chǎn)管理局，貴州荔波558400； 4. 貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴陽550004)

樹蛙科Rhacophoridae泛樹蛙屬Polypedates廣泛分布于印度東部、菲律賓和婆羅洲以及東南亞等地區(qū)，目前該屬記錄有24種(Frost，2018)，中國分布有4種(Frost，2018；中國兩棲類，2018)，這4個(gè)物種各自成單系，均屬于Polypedatesleucomystax復(fù)合體(Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。該屬物種的分類研究存在一定爭議(Brownetal.，2010；Sheridanetal.，2010；Riyantoetal.，2011；Kuraishietal.，2013)?；谇叭说南嚓P(guān)研究(Lietal.，2008，2009；Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2013)，Pan等(2013)基本理清了東南亞分布泛樹蛙屬物種的分類地位，確定了中國分布有泛樹蛙屬物種4種，即布氏泛樹蛙Polypedatesbraueri、凹頂泛樹蛙Polypedatesimpresus、斑腿泛樹蛙Polypedatesmegacephalus和無聲囊泛樹蛙Polypedatesmutus。然而，泛樹蛙屬物種在形態(tài)性狀上的保守性以及繁殖方式和棲息地環(huán)境的相似性，物種間的分類地位及分布目前仍存在較大爭議。

目前，斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙被廣泛記錄于貴州省各區(qū)縣(伍律等，1986；陳繼軍等，2007；李仕澤等，2015；黃靜等，2016；魏剛等，2017；姚正明等，2018)。在以往研究中(Yuetal.，2009；Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2013；Lietal.，2013；Panetal.，2013)，除Li等(2013)使用了來自貴州省貴陽地區(qū)的1號(hào)樣本外(樣本編號(hào)：LJTV96)，其他研究均缺乏來自貴州地區(qū)的泛樹蛙屬物種樣品。因此，關(guān)于貴州地區(qū)泛樹蛙屬物種的組成和分布記錄有待進(jìn)一步厘定。

2016—2018年在貴州茂蘭國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)、黃平縣朱家山縣級(jí)自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行本底資源調(diào)查時(shí)采集到數(shù)只泛樹蛙屬物種標(biāo)本，基于形態(tài)學(xué)比較和分子系統(tǒng)學(xué)分析鑒定為布氏泛樹蛙和凹頂泛樹蛙，為貴州省2新記錄。本研究對(duì)貴州分布的布氏泛樹蛙和凹頂泛樹蛙進(jìn)行了形態(tài)學(xué)描述，并補(bǔ)充了其分子生物學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采自貴州茂蘭國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(108°01′24.02″E，25°13′28.90″N，海拔528 m；以下簡稱貴州茂蘭)、貴州省黃平縣朱家山縣級(jí)自然保護(hù)區(qū)(107°39′44.49″E，26°54′35.23″N，海拔833 m；以下簡稱貴州黃平)，共11號(hào)成體標(biāo)本(4號(hào)斑腿泛樹蛙、3號(hào)凹頂泛樹蛙和4號(hào)布氏泛樹蛙)，對(duì)其中6雄2雌(斑腿泛樹蛙3號(hào)雄性、凹頂泛樹蛙1號(hào)雌性和布氏泛樹蛙3號(hào)雄性、1號(hào)雌性)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)性狀測(cè)量，取腿部肌肉保存于90%乙醇；10%福爾馬林浸泡標(biāo)本，保存于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物生態(tài)學(xué)標(biāo)本室。

1.2 DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序

總DNA提取自保存于90%乙醇中的標(biāo)本腿部肌肉，使用DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN Catalog No.69504)。選擇12S-16SrRNA基因片段作為分子標(biāo)記，擴(kuò)增引物為FS01：5’-AACGCTAAGATGAACCCTAAAAGTTCT-3’；Rend：5’-GACCTGGATTACTCCGGTCTGA-3’(劉秋成等，2018)。擴(kuò)增產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司雙向測(cè)序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序后在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，確定所擴(kuò)增片段為12S-16SrRNA基因。在進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，選擇Pan等(2013)使用的泛樹蛙屬物種12S-16SrRNA序列，以Polypedatesotilophus、P.colletti、P.maculatus、Polypedatessp.和P.macrotis為外群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(表1)。

用貝葉斯法(BI)和最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來確定本研究樣本的分類地位。最適模型基于赤池信息準(zhǔn)則(AIC)在PartitionFinder 2(Lanfearetal.，2012)進(jìn)行模型選擇(最適模型為GTR+I+G)。BI分析在MrBayes 3.2(Ronquistetal.，2012)進(jìn)行(參數(shù)設(shè)置為nruns=4，ngen=2 000 000，samplefreq=100，nchains=4，burnin=5 000)。在Tracer 1.6(Rambautetal.，2013)中查看了相關(guān)運(yùn)行參數(shù)的收斂性和有效樣本量。在IQ-TREE(Nguyenetal.，2014)中運(yùn)行1 000次Bootstrap重復(fù)抽樣分析(運(yùn)行模型與貝葉斯相同)。在MEGA 7.0中以物種為組采用分組的方法計(jì)算貴州樣品與Polypedatesleucomystax復(fù)合體物種間的遺傳距離(p-distances)。

1.4 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)測(cè)量

依據(jù)費(fèi)梁等(2009)，使用游標(biāo)卡尺(Serial No.14133868，德國)測(cè)量25個(gè)形態(tài)特征(精確度0.01 mm)：體全長(SVL)、頭長(HDL)、頭寬(HDW)、吻長(SL)、眼徑(ED)、鼓膜徑(TD)、眶間距(IOS)、上眼瞼寬(UEW)、鼻間距(IND)、鼻眼距(NED)、鼻吻距(NSD)、鼓膜距離眼后角的距離(ETD)、兩眼前角距(IFE)、兩眼后角距(IAE)、前臂及手長(LAL)、前臂寬(LW)、手長(HL)、腿長(THL)、脛長(TL)、脛寬(TW)、附足長(TFL)、足長(FL)、第三指吸盤寬(FDW)和第四趾吸盤寬(DPW)。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

將采自貴州茂蘭、貴州黃平的11號(hào)泛樹蛙標(biāo)本的12S-16SrRNA序列上傳到GenBank，登錄號(hào)詳見表1。對(duì)泛樹蛙屬10個(gè)物種共計(jì)57號(hào)標(biāo)本的12S-16SrRNA序列進(jìn)行多重序列比對(duì)拼接后的堿基長度為2 368 bp?；?2S-16SrRNA序列計(jì)算的泛樹蛙屬物種間遺傳距離為1.19%～8.79%(表2)。本研究采自貴州茂蘭的泛樹蛙標(biāo)本(GenBank登錄號(hào)：MK481032、MK481033、MK481034)與Pan等(2013)的凹頂泛樹蛙之間的遺傳距離為1.19%，貴州黃平和茂蘭的泛樹蛙標(biāo)本(GenBank登錄號(hào)：MK481039、MK481029、MK481030、MK481031)與Pan等(2013)的布氏泛樹蛙之間的遺傳距離為1.49%，貴州茂蘭的泛樹蛙標(biāo)本(GenBank登錄號(hào)：MK481035、MK481036、MK481037、MK481038)與Pan等(2013)的斑腿泛樹蛙之間的遺傳距離為2.32%(表2)。

表1 本研究中使用的樣本和序列的GenBank登錄號(hào)Table 1 Samples used in this study and GenBank accession numbers for sequences

種名Species標(biāo)本號(hào)Voucher ID采集地LocalitiesGenBank登錄號(hào)GenBank accession number來源ReferencesP. leucomystaxMZB UNTemanggung, Java, IndonesiaAB728135Kuraishiet al., 2013JAM 3211Lombok Island, IndonesiaHM770313Brown et al., 2010MZB Amp 12864Banyuwangi, Java, IndonesiaAB728137Kuraishiet al., 2013KUHE 23555Brostagi, Sumatra, IndonesiaAB728128Kuraishiet al., 2013BORN 23373Keningau, Sabah, MalaysiaAB728143Kuraishiet al., 2013BORN 22430Tampaluri, Sabah, MalaysiaAB728144Kuraishiet al., 2013FMNH 244922Sabah, MalaysiaHM770266Kuraishiet al., 2013FMNH 231040Sabah, MalaysiaHM770281Brown et al., 2010外群P. otilophusKUHE 42555Kanowit, Sarawak, MalaysiaAB728190Kuraishiet al., 2013P. collettiMZB UNLampung, Sumatra, IndonesiaAB728189Kuraishiet al., 2013P. maculatusKUHE 42336Rajgir, Bihar, IndiaAB728188Kuraishi et al., 2013P. macrotisKUHE 42556Kanowit, Sarawak, MalaysiaAB728187Kuraishiet al., 2013Polypedates sp.KUHE 52552Temerloh, Pahang, MalaysiaAB728185Kuraishiet al., 2013

注：*標(biāo)本保存于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物生態(tài)實(shí)驗(yàn)室， 由羅濤采集

Notes：*the specimens are kept in the Animal Ecology Laboratory， School of Life Sciences， Guizhou Normal University， all samples were collected by Luo Tao

表2 Polypedates leucomystax復(fù)合體物種間的遺傳距離Table 2 Uncorrected pairwise distances among species in the Polypedates leucomystax complex

注：#來自貴州泛樹蛙屬物種樣品

Note：#Polypedatesspecies were from Guizhou province

基于BI和ML構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹產(chǎn)生了相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖1)，僅在末端分支節(jié)點(diǎn)上存在一些差異。從系統(tǒng)發(fā)育樹可知，來自貴州黃平的泛樹蛙樣本(GenBank登錄號(hào)：MK481029、MK481030、MK481031)和貴州茂蘭的樣本(GenBank登錄號(hào)：MK481039)與布氏泛樹蛙聚為一支(BPP=1.00，BSP=80)，來自貴州茂蘭的樣本(GenBank登錄號(hào)：MK481035、MK481036、MK481037、MK481038)與斑腿泛樹蛙聚為一支(BPP=1.00，BSP=99)，來自貴州茂蘭的樣本(GenBank登錄號(hào)：MK481032、MK481033、MK481034)與凹頂泛樹蛙聚為一支(BPP=1.00，BSP=10)，與Pan等(2013)的研究有相似的樹形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明，采自貴州茂蘭、黃平的泛樹蛙屬物種標(biāo)本為布氏泛樹蛙(GenBank登錄號(hào)：MK481039、MK481029、MK481030、MK481031)、凹頂泛樹蛙(GenBank登錄號(hào)：MK481039、MK481029、MK481030、MK481031)及斑腿泛樹蛙(GenBank登錄號(hào)：MK481035、MK481036、MK481037、MK481038)。

圖1 基于線粒體12S rRNA和16S rRNA基因構(gòu)建的Polypedates leucomystax復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Polypedates leucomystax complex constructed based on mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA gene

紅色表示來自本研究的樣本

Red indicates the samples used in this study

2.2 鑒定與形態(tài)描述

2.2.1 布氏泛樹蛙的形態(tài)特征雄蛙體長約53.11 mm，雌蛙約56.57 mm(表3)；頭寬與頭長約等寬；吻前端鈍，鼻孔近吻端；眶間距約為上眼瞼距的4/3；鼓膜直徑約為眼徑的2/3；顳褶顯著；內(nèi)鼻孔位置靠后，幾乎達(dá)眶前緣，左右分開較大；犁骨齒長，略向后斜列，左右相距較窄；指、趾端均具吸盤，指吸盤大于趾吸盤，但小于鼓膜直徑；第一指長小于第二指長，指關(guān)節(jié)下瘤明顯；貼體前伸達(dá)眼前端；趾蹼約為3/4；內(nèi)蹠突大而突出，橢圓形，無外蹠突。

體背皮膚較為光滑，疣粒細(xì)小，但腹部及四肢腹側(cè)皮膚較為粗糙；自眼后角開始，身體兩側(cè)各有一窄細(xì)膚褶，有的個(gè)體經(jīng)前臂上方一直延伸至腹股溝區(qū)，但大多數(shù)個(gè)體此膚褶較短，經(jīng)肩部上方向下延伸而止于靠近前肢下方處。浸泡標(biāo)本背部淺灰色或深棕灰色；眼眶間靠近上眼瞼處可見略呈三角形的淺黑色斑紋；背部散有不規(guī)則黑色小斑塊；體側(cè)皮膚有較多的黑色斑點(diǎn)；四肢背側(cè)橫紋清晰；股部后方有多個(gè)較大白色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)之間的皮膚顏色為深黑色，此特征在淺灰色的浸泡標(biāo)本里面更顯著；腹側(cè)皮膚黃白色(圖2，圖3)。

表3 貴州分布3種泛樹蛙物種的測(cè)量性狀量度Table 3 Morphological traits of 3 Polypedates species in Guizhou province

2.2.2 凹頂泛樹蛙的形態(tài)特征雌蛙體長約69.59 mm(表3)；身體扁而窄長；頭部扁平，頭長寬幾相等，頭頂下凹明顯，頭頂皮膚緊貼額頂骨，不能分離；吻端鈍尖，略超過下頜；吻棱顯著；鼓膜圓，緊接眼后，小于上眼瞼寬；犁骨齒列長，橫列在內(nèi)鼻孔前內(nèi)側(cè)，左右不相遇；背側(cè)褶無；前肢較粗壯，前臂及手長約為體長之半；指端有大的吸盤，其腹面邊緣有馬蹄形溝，第一指吸盤較??；指長順序：3>4>2>1，第四指略短于第三指；指間一般無蹼或略顯蹼跡，指側(cè)均有緣膜；關(guān)節(jié)下瘤大而明顯，指基下瘤明顯；掌突2個(gè)。后肢較細(xì)長，約為體長的1.7倍，后肢前伸貼體脛附關(guān)節(jié)達(dá)吻端或鼻孔；脛長約為體長之半，左、右跟部不重疊，足長小于脛長；趾長順序：4>5>3>2>1，第五趾略長于第三趾；趾間具蹼，缺刻深，第四趾外側(cè)蹼達(dá)第一、第二關(guān)節(jié)下瘤之間，其余各趾以緣膜達(dá)趾端；外側(cè)趾間蹼不甚發(fā)達(dá)；關(guān)節(jié)下瘤顯著，蹠部有成行小疣；內(nèi)蹠突細(xì)窄，外蹠突小而不顯；指、趾端均具吸盤和邊緣溝；指、趾吸盤背面可見“Y”形跡；指細(xì)長無蹼；外側(cè)蹠間約具1/2蹼，趾間半蹼；有內(nèi)蹠突，無外蹠突。

圖2 貴州省分布的3種泛樹蛙
Fig. 2 ThreePolypedatesspecies distributed in Guizhou province

A1～A7.凹頂泛樹蛙Polypedatesimpresus， B1～B2. 斑腿泛樹蛙P.megacephalus， C. 布氏泛樹蛙P.braueri

圖3 凹頂泛樹蛙、斑腿泛樹蛙和布氏泛樹蛙在保存狀態(tài)下的背側(cè)(A1、B1、C1)、 腹側(cè)(A2、B2、C2)和左側(cè)(A3、B3、C3)Fig. 3 Dorsal (A1， B1， C1)， ventral (A2， B2， C2)， and lateral (A3， B3， C3) views ofPolypedates impresus， P. megacephalus and P. braueri in preservation

皮膚較光滑，頭頂部皮膚與頭骨相連；背面滿布均勻小疣粒；顳褶平直，達(dá)肩部逐漸消失，鼓膜后方至肩部上方為黑色。胸腹部、體側(cè)及股下方密布扁平圓疣。

背部為棕色或棕褐色，具“X”形斑紋，隱或不顯，具不均勻的小黑斑，咽胸部較光滑，胸腹部和股腹面密布扁平疣。頭體及股部腹面乳白或乳黃色，僅咽喉部略褐色斑點(diǎn)；整個(gè)背面為淺棕色，體背面無斑紋或在肩部略顯“X”形斑；上唇緣白色，顳部有1條棕色橫紋；四肢背面均有深棕色橫紋，體側(cè)無斑；股后部無灰褐色網(wǎng)狀斑紋；前肢腹面和脛、跗、足部腹面為淺肉色，且具小麻斑；肛部有乳白色的扁平疣粒(圖2，圖3)。

2.3 生態(tài)環(huán)境及其習(xí)性

本研究的凹頂泛樹蛙、布氏泛樹蛙和斑腿泛樹蛙棲息環(huán)境相似，均生活在530～800 m的山間農(nóng)田及其旱地生境中，周圍水域以靜水域?yàn)橹?，常棲息生活于稻田、草叢中，周圍喬灌木甚少。同域分布的澤陸蛙Fejervaryamultistriata、飾紋姬蛙Microhylafissipes、小弧斑姬蛙Microhylaheymonsi和黑斑側(cè)褶蛙Pelophylaxnigromaculata為優(yōu)勢(shì)種。

5月可見大量個(gè)體交配，卵泡產(chǎn)于靜水域稻田的水稻幼苗和周圍的草叢近水處。約1周孵化完畢，蝌蚪進(jìn)入靜水即可游動(dòng)。

3 討論

泛樹蛙屬物種間的形態(tài)差異較小，繁殖模式和棲息地環(huán)境極為相似，中國大陸地區(qū)長期以來被認(rèn)為由斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙組成(費(fèi)梁等，2009，2012)。近年來，基于分子系統(tǒng)學(xué)的研究基本理清了東南亞地區(qū)泛樹蛙屬物種的分類地位(Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。貴州省地處中國西南部，位于第二階梯之上，并處于第一階梯向第二階梯的過渡地段。較多的新物種在該地區(qū)被描述(徐寧等，2007；李松等，2008a，2008b，2010；Zhaoetal.，2008；Yangetal.，2011；王超等，2013；Wangetal.，2013；Heetal.，2015；Dengetal.，2016；Chenetal.，2017；Zhangetal.，2017；Liuetal.，2018；Lietal.，2018；李春青等，2018；Wuetal.，2018)。這表明該地區(qū)的物種多樣性較高，其物種多樣性在以往可能被低估。依據(jù)泛樹蛙屬物種背部的斑紋，即“X”形斑或者背部縱紋的數(shù)目，貴州地區(qū)該屬物種被記錄為斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙(伍律等，1986；陳繼軍等，2007；李仕澤等，2015；黃靜等，2016；魏剛等，2017；姚正明等，2018)，但采用物種的體色和體背“X”形斑等特征并不能準(zhǔn)確區(qū)分這2個(gè)物種(劉秋成等，2018)，因而，依據(jù)背部“X”形斑作為分類依據(jù)將貴州地區(qū)泛樹蛙屬物種分類為斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，貴州地區(qū)目前應(yīng)該分布有泛樹蛙屬物種3種，即布氏泛樹蛙、凹頂泛樹蛙和斑腿泛樹蛙，但這3個(gè)物種的分布范圍和是否有無聲囊泛樹蛙在貴州的分布有待使用分子標(biāo)記并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行研究。

致謝：感謝荔波世界自然遺產(chǎn)管理局生物多樣性監(jiān)測(cè)項(xiàng)目資助、黃平縣朱家山縣級(jí)自然保護(hù)區(qū)工作人員在調(diào)查過程中提供的幫助。