崔穎秋，韓 瑾，許澍錚，潘 敏，甄 理，張永玲，楊 昕，李 茹，李東至，廖 燦

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623)

唇腭裂(cleft lip with or without cleft palate,CL/P)是最常見的顏面部畸形，是世界范圍內(nèi)最常見的出生缺陷之一，其發(fā)病率在不同地區(qū)、種族、人群和性別中有所不同，新生兒的發(fā)病率為1‰～7‰[1]。唇腭裂不僅造成患兒的容貌畸形，影響患兒吸吮、吞咽、語(yǔ)言等功能及面部發(fā)育，甚至影響患兒心理發(fā)育，青少年唇腭裂者焦慮癥的發(fā)病率較高，需要早期的心理干預(yù)。唇腭裂如果并發(fā)其他遺傳性疾病者還伴有原發(fā)性智力低下和多器官畸形及功能異常。

唇腭裂的發(fā)病原因目前尚未完全闡明，大致可分為遺傳因素、環(huán)境因素和疾病藥物因素三個(gè)方面，從遺傳因素可將唇腭裂病因分為三大類：染色體異常、單基因病和多基因病[2]，因此唇腭裂的復(fù)雜性增加了產(chǎn)前臨床咨詢及處理的難度?？截悢?shù)變異(copy number variations,CNVs)是由基因組重排而導(dǎo)致的DNA長(zhǎng)度>1kb的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或減少，是基因組結(jié)構(gòu)變異的重要組成部分，主要表現(xiàn)為染色體微缺失或微重復(fù)。CNVs目前已被廣泛應(yīng)用于胎兒結(jié)構(gòu)畸形、原發(fā)性智力低下、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、自閉癥及多發(fā)畸形等異常的診斷及腫瘤遺傳學(xué)診斷等領(lǐng)域。本研究中我們應(yīng)用染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)對(duì)100例產(chǎn)前超聲診斷唇腭裂胎兒進(jìn)行檢測(cè)，探討唇腭裂胎兒的基因組學(xué)病因及CMA技術(shù)在唇腭裂胎兒中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2014年1月至2017年12月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心診斷的唇腭裂病例100例，其中單純性唇裂24例，唇腭裂55例，合并其它結(jié)構(gòu)畸形21例(合并神經(jīng)系統(tǒng)異常9例、心血管畸形8例，合并腹壁畸形、腎畸形、肢體畸形及軟指標(biāo)各1例)。產(chǎn)前診斷孕婦均填寫基本信息登記表，包括年齡、體重、末次月經(jīng)、種族、生育史、疾病史、家族遺傳病史及在本次妊娠期間是否接觸過病毒感染及接觸過明顯致畸物質(zhì)等。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，取得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，征得受試者、監(jiān)護(hù)者同意。

1.2 儀器和方法

CMA檢測(cè)按照美國(guó)Affymetrix公司生產(chǎn)的CytoScan HD芯片檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程操作，應(yīng)用配套的ChAS軟件及生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2009)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體核型分析診斷，CytoScan HD芯片同時(shí)具備195萬(wàn)個(gè)CNV探針和75萬(wàn)個(gè)SNP探針。

1.3 產(chǎn)前診斷

在孕婦及家屬知情同意下，自愿選擇超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺術(shù)(16～24周)或臍帶血穿刺術(shù)(>24周)，獲得胎兒羊水或臍血樣本。孕婦取仰臥位，常規(guī)腹壁消毒，超聲(Philips iU22，荷蘭)引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺或臍帶血穿刺術(shù)，獲取胎兒標(biāo)本(羊水20mL或臍帶血1.5mL)。同時(shí)抽取其家系成員外周血2mL注入EDTA抗凝管中，顛倒混勻后置于4℃冰箱中保存，剩余標(biāo)本置-80℃保存。

1.4 CMA數(shù)據(jù)分析

CMA數(shù)據(jù)分析采用ChAS 2.0軟件，選取長(zhǎng)度≥100kb缺失/重復(fù)片段(可信度≥90%)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以CEL文件格式進(jìn)行分析。根據(jù)CNVs的性質(zhì)不同,將其分為致病性CNVs、不明確意義CNVs(variants of unknown significance，VOUS)及良性CNVs三類。數(shù)據(jù)分析過程參考在線公共數(shù)據(jù)庫(kù)如OMIM(http://www.omim.org)、DGV(http://www.projects.tcag.ca/variation)、USCS(http://genome.ucsc.edu)、PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)、DECIPHER(http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher)。

1.5 產(chǎn)后隨訪

所有病例均進(jìn)行了妊娠結(jié)局及分娩后半年的隨訪，包括分娩的孕周、分娩方式、出生后身高、體重、阿氏評(píng)分、新生兒篩查的情況，生長(zhǎng)發(fā)育評(píng)估中各個(gè)系統(tǒng)的情況及手術(shù)治療后的效果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示，用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMA研究結(jié)果

CMA結(jié)果顯示共12例病例檢出致病性CNVs，致病性CNVs總檢出率為12.0%(12/100)，其中唇腭裂9.1%(5/55)，合并其它畸形33.3%(7/21)，VOUS在單純性唇裂、唇腭裂和唇腭裂合并其他畸形病例中的比例分別為0、1.8%和28.6%，見表1、表2。單純性唇裂病例中未檢測(cè)出致病性CNVs。唇腭裂胎兒和合并其他畸形異常胎兒的致病性CNVs檢出率分別為9.1%(5/55)和33.3%(7/21)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.112，P<0.05)。

表1 先天性唇腭裂胎兒不同性質(zhì)CNVs的檢出率比較[n(%)]

2.2 產(chǎn)后隨訪

本研究對(duì)全部病例均進(jìn)行了電話隨訪及產(chǎn)后超聲復(fù)查，以了解患者妊娠結(jié)局及產(chǎn)后超聲復(fù)查結(jié)果，見表2、圖1、圖2。

表2 12例檢出致病性CNVs先天性唇腭裂胎兒列表

注：A為產(chǎn)前三維超聲顯示胎兒唇裂；B為CMA結(jié)果圖，示22號(hào)染色體22q11.21-q11.22區(qū)域1.24Mb的缺失[arr22q11.21-q11.22(21464763-22706413)X1]。

圖1病例3三維超聲與CMA結(jié)果圖
Fig.1 Image of ultrasound and CMA result of case 3

注：A1、A2為產(chǎn)前三維超聲，顯示胎兒唇腭裂；B為產(chǎn)前診斷病例12家系圖；C1、C2為G顯帶染色體核型(全核型和局部核型)：46,XX,der(7)；C3為孕婦G顯帶染色體核型：46,XX,t(7;11)(q36;q21)；D1和D2為CMA結(jié)果圖示11q21-q25 38.81Mb重復(fù)及7q36.3區(qū)域1.50Mb缺失。

圖2病例12三維超聲與染色體核型圖及CMA結(jié)果圖
Fig.2 Image of ultrasound， G-band karyotype and CMA of case 12

3 討論

3.1 先天性唇腭裂遺傳致病原因

唇腭裂的發(fā)病原因及機(jī)制極其復(fù)雜，僅通過人類孟德爾遺傳在線(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)查詢就可發(fā)現(xiàn)大約500種疾病與唇腭裂相關(guān)，其中包括100種以上的孟德爾遺傳綜合征、染色體片段的缺失或重復(fù)、家族遺傳及散發(fā)病例。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因研究方法的不斷涌出，以及基因組序列改變引發(fā)胚胎發(fā)育異常相關(guān)研究的深入，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)與唇腭裂的發(fā)生有關(guān)，同時(shí)也對(duì)臨床病因?qū)W的診斷造成困難。CNVs在許多人類疾病如發(fā)育異常、腫瘤、遺傳型疾病及畸形的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，同樣也是導(dǎo)致先天性唇腭裂畸形的重要病因之一。本研究所使用CNVs檢測(cè)技術(shù)具有高分辨識(shí)別基因組不平衡拷貝數(shù)變異、單親二倍體(UPD)及較低水平嵌合體的CMA技術(shù)，在快速識(shí)別和鑒定疾病相關(guān)基因方面具有較高的優(yōu)勢(shì)。

3.2 唇腭裂致病性CNVs分析

本研究采用Affymetrix公司的CytoScan HD芯片平臺(tái)共計(jì)對(duì)100例唇腭裂病例進(jìn)行檢測(cè)，是目前已有為數(shù)不多的大樣本產(chǎn)前診斷唇腭裂CNVs研究，因此對(duì)臨床實(shí)踐具有較好的指導(dǎo)意義。目前國(guó)際上關(guān)于產(chǎn)前唇腭裂研究的一個(gè)大樣本報(bào)道是香港中文大學(xué)聯(lián)合貝勒醫(yī)學(xué)院的多中心研究，研究共計(jì)對(duì)270例產(chǎn)前唇腭裂病例進(jìn)行檢測(cè)，其中病理性CNVs的檢出率為14.8%，略高于本研究12.0%，而綜合征性唇腭裂檢出率為21.4%[3]，本研究為33.3%，考慮以上數(shù)據(jù)差異與不同研究的研究人群、檢測(cè)平臺(tái)及分析方法等有關(guān)。本研究12例CMA異常的病例中共計(jì)15個(gè)致病性CNVs，其中有8個(gè)CNVs片段小于10Mb，而這些異常片段不能常規(guī)通過G顯帶染色體核型技術(shù)檢出，因此通過CMA的研究，可以額外檢出7%的致病性CNVs。

在本研究病例中，致病性CNVs片段分布在染色體4p16.3，6q25.2，7q32-36，7q35，11q21-25，15q13.3，18q21-23，18p11.3，22q11.2，21q22.2，分別分布在不同染色體，沒有明確的規(guī)律，參考唇腭裂專科數(shù)據(jù)庫(kù)(Dutch Oral Cleft Registry，NVSCA)。以上研究結(jié)果均說明高分辨全基因組檢測(cè)技術(shù)對(duì)先天性唇腭裂的病因?qū)W檢測(cè)具有一定的優(yōu)勢(shì)[4]。在100例唇腭裂病例中，單純性唇裂病例未檢測(cè)出致病性CNVs，唇腭裂病例中致病性CNVs的檢出率為9.1%，而合并其他畸形即綜合征性唇腭裂的致病性CNVs檢出率提升至33.0%，顯著高于唇腭裂病例組。

3.3 典型的染色體CNVs病例分析

本研究共有2例病例診斷為22q11.2微缺失綜合征，也稱為腭-心-面綜合征。2例胎兒均表現(xiàn)為先天性唇腭裂、心臟畸形。該類綜合征在活產(chǎn)兒的發(fā)病率為1/800～1/4 000[5]，臨床表現(xiàn)差異較大，主要表現(xiàn)為先天性心臟病、唇腭裂、低鈣血癥、面容異常、認(rèn)知行為及精神異常。由于該疾病存在外顯率不同，我們對(duì)2例胎兒的父母均進(jìn)行了CMA檢測(cè)，顯示致病性CNVs均由新發(fā)突變產(chǎn)生，且致病區(qū)域位于經(jīng)典的缺失區(qū)域。22q11.2微缺失綜合征致病性區(qū)域累及30多個(gè)功能基因，其中較為熱點(diǎn)的基因分別為TBX1、CRK1、COMT、UFD1L、DCGCR-6、GNB1L、MED15、CLTCL等，在這些功能基因中，UFD1L在胚胎組織中的表達(dá)影響腭咽弓和心臟流出道發(fā)育，編碼蛋白在第1～4咽弓尖端呈高度表達(dá)，尤其在腭部發(fā)育的原始部位，是22q11為缺失病例唇腭裂形成的關(guān)鍵基因。

本研究中共有2例18q21缺失綜合征病例，2例均常規(guī)進(jìn)行G顯帶染色體分析，核型分別為46,XX,r(18)(p11q23)和46,XX,del(18)(q21.3)，經(jīng)CMA證實(shí)均為18號(hào)染色體長(zhǎng)臂部分缺失的畸變。18號(hào)染色體長(zhǎng)臂部分缺失是一種少見的染色體異常改變，在活產(chǎn)兒中的發(fā)生率約為1/40 000[6]，臨床表現(xiàn)差異度較大，且隨著缺失片段位置及大小的不同而不同，主要表現(xiàn)為身材矮小、小頭畸形、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、唇腭裂及心臟畸形等，與本研究2例病例表型基本相似。18q21缺失綜合征在唇腭裂表型的關(guān)鍵區(qū)域[7]，包含2個(gè)重要基因，分別為SALL3基因和TSHZ1基因。SALL3基因編碼蛋白屬于C2H2型鋅指蛋白家族，該蛋白在小鼠腭及舌中均呈高表達(dá)狀態(tài)，尤其在胚胎發(fā)育期原發(fā)腭與繼發(fā)腭融合時(shí)可檢測(cè)到SALL3基因表達(dá)量增加[8]。另一基因TSHZ1編碼的蛋白屬鋅指蛋白家族，在嗅球發(fā)育中起關(guān)鍵作用[9]。本研究中2例18q21缺失綜合征的樣本均表現(xiàn)為先天性腭裂畸形，推測(cè)與SALL3和TSHZ1基因有關(guān)，當(dāng)二者發(fā)生單倍劑量不足時(shí)會(huì)導(dǎo)致腭裂畸形的形成。

由于產(chǎn)前診斷病例存在臨床表型的不完整特點(diǎn)，建議產(chǎn)前診斷唇腭裂病例應(yīng)用CMA檢測(cè)。其中病例12，孕婦曾有唇腭裂胎兒引產(chǎn)史，CMA結(jié)果顯示7q36.3區(qū)域出現(xiàn)1.50Mb缺失[arr7q36.3 (157615631-159119707)X1]及11q21-q25 38.81Mb重復(fù)[arr11q21-q25(96130099～134937416)X3]，隨后檢查父母染色體顯示母親染色體為46,XX,t(7;11)(q36;q21)，父親染色體正常，該區(qū)域富含200余個(gè)OMIM基因。通過文獻(xiàn)回顧發(fā)現(xiàn)11q重復(fù)綜合征是較為罕見的臨床綜合征[9]，雖然唇腭裂的臨床表現(xiàn)并不是常見的表現(xiàn)之一，但本研究孕婦曾有唇腭裂的胎兒引產(chǎn)史，且孕婦本人為染色體的平衡易位攜帶者，因此考慮兩胎的唇腭裂表現(xiàn)均與染色體異常高度相關(guān)。該片段中包含YAP1和PVRL1基因[10]，YAP1基因編碼的蛋白過度表達(dá)將影響細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、黏附、上調(diào)ITGB2基因的表達(dá)。PVRL1基因異常與CLPED1綜合征有關(guān)，即唇裂-腭發(fā)育不良綜合征，患者表現(xiàn)為唇腭裂、手足發(fā)育異常及智力低下。在小鼠的動(dòng)物模型中也證實(shí)PVRL1基因的異常會(huì)導(dǎo)致小數(shù)切牙及腭發(fā)育異常。Williamson等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)PVRL1基因的異常與非綜合征性的唇腭裂表現(xiàn)高度相關(guān)。除12號(hào)病例外，還有另外4例產(chǎn)前診斷病例均檢測(cè)到致病性CNVs，但超聲的表現(xiàn)均為單一的唇腭裂。由于產(chǎn)前診斷檢測(cè)手段的局限和胎兒臨床表型的不完整，更加說明CMA檢測(cè)技術(shù)在唇腭裂病例的應(yīng)用對(duì)臨床指導(dǎo)的意義與價(jià)值。

綜上所述，CMA技術(shù)也有一定的局限性，在臨床實(shí)踐中可能會(huì)發(fā)現(xiàn)大量的臨床意義不明確CNVs，即VOUS，這將會(huì)給遺傳咨詢與臨床處理帶來困難。建議對(duì)病例的父母進(jìn)行基因組DNA的檢測(cè)以幫助診斷CNVs片段的來源以協(xié)助指導(dǎo)臨床的咨詢，由于唇腭裂是高發(fā)的胎兒出生缺陷之一，且是多種染色體異常和綜合征的表現(xiàn)之一，因此建議對(duì)唇腭裂胎兒進(jìn)行CMA檢查進(jìn)行產(chǎn)前診斷。