方 晴 葉 琴 朱育銀
耐多藥結(jié)核或耐利福平結(jié)核(MDR-TB/RR-TB)的發(fā)病率和死亡率下降趨勢相似,結(jié)核病的早期診斷對于結(jié)核病的防治尤為重要[1]。在分枝桿菌感染期間,microRNAs(miRNAs)是免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子[2]。miRNAs 是多種生物過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,是包括結(jié)核病在內(nèi)的多種疾病診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后的新型生物標志物[3-5]。本研究分析miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 三種血漿游離miRNAs 在診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核中的價值,現(xiàn)報道如下。
1.1 一般資料 隨機選取2015 年4 月—2017 年11月于中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院肺科收治的結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核患者95 例作為病例組。根據(jù)病例組年齡、性別匹配選擇同期健康體檢者95 名作為對照組。兩組均排除糖尿病、乙型肝炎、免疫缺陷病或其他肺相關(guān)疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過,與所有受試者均簽署知情同意書。
1.2 RNA 提取 所有受試者均取空腹肘靜脈血約3mL,靜置30min 后,4℃,2000r/min 離心20min,收集上清,保存于-80℃冰箱。使用TRIzol 試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA) 提 取 血 漿 中 游 離miRNAs,溶于無核酸酶水(AmbionTM,貨號AM9932,批號1508254)中并保存在-80℃冰箱。
1.3 RT-PCR 分析miRNAs 表達 本研究RT-PCR的引物設(shè)計如下,miR-769-5p 上游引物:5'-GCGGCGGCTGGGATCTCCGGGGTC-3';下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。miR-320a 上 游 引 物:5'-AAAAGCTGGGTTGAGAGG-3';下游引物:5'-AACATGTACAGTCCATGGATG-3'。miR-22-3p 上 游 引物:5'-GGGAAGCTGCCAGTTGAAG-3';下游引物:5'-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3'。let-7 上 游引物:5'-ACCAAGACCGACTGCCCTTT-3';下游引物:5'-CTCTGTCCACCGCAGATATT-3'[6]。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas,貨號K1622,批號00176496) 合成cDNA,將反應(yīng)混合物在16℃下孵育15min,在42℃下孵育1h,在85℃下孵育5min,并保持在4℃。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。本實驗中所有檢測均一式三份。let-7d、let-7g 和let-7i(let-7d/g/i)的組合用作標準化RT-PCR 數(shù)據(jù)的內(nèi)源對照[6-7],將miRNAs 的相對水平歸一化至let-7d/g/i,并使用2-ΔΔCt 方法計算。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差() 表示,采用Student's t 檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)表示,采用雙側(cè)χ2檢驗比較組間差異。構(gòu)建受試者操作特征(ROC)曲線和ROC 曲線下面積(AUC)以評估候選miRNAs 對結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的預(yù)測能力。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 病例組和對照組一般資料比較 病例組年齡32~79 歲,平均(45.82±12.74)歲;男65 例,女30 例;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(20.15±2.24)kg/m2;有結(jié)核病治療史24 例。對照組年齡30~75 歲,平均(46.27±13.59)歲;男62 名,女33 名;BMI(22.43±2.31)kg/m2;無結(jié)核病治療史。病例組和對照組年齡、性別等比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性;病例組患者BMI 顯著低于對照組(P<0.01)。
2.2 不同年齡層、性別間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較 不同年齡層、性別間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1-2。
2.3 病例組與對照組血漿miR-769-5p、miR-320a和miR-22-3p 水平比較 病例組患者血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平均顯著低于對照組(P<0.01),見表3。
表1 不同年齡間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較
表1 不同年齡間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較
組別年齡>60 歲年齡≤60 歲t 值P 值例數(shù)63 127 miR-769-5p 10.36±10.27 12.00±11.75 0.94 0.35 miR-320a 629.11±326.90 596.97±358.85 0.60 0.55 miR-22-3p 0.42±0.22 0.45±0.24 0.83 0.41
表2 不同性別間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p水平比較
表2 不同性別間血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p水平比較
組別男性女性t 值P 值例數(shù)127 63 miR-769-5p 11.69±11.47 10.98±10.95 0.48 0.68 miR-320a 476.72±269.60 530.10±340.13 1.09 0.28 miR-22-3p 0.38±0.19 0.42±0.25 1.12 0.26
表3 肺結(jié)核患者與健康體檢者血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較
表3 肺結(jié)核患者與健康體檢者血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平比較
組別病例組對照組t 值P 值例數(shù)95 95 miR-769-5p 1.25±0.35 19.88±5.36 33.81<0.01 miR-320a 398.65±56.64 801.52±77.85 40.79<0.01 miR-22-3p 0.31±0.15 0.54±0.22 8.42<0.01
2.4 血漿miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核 為評價所選擇的血漿miRNAs 對結(jié)核病患者和健康對照者的鑒別作用,采用整個樣本集進行ROC 曲線分析。ROC 曲線分析結(jié)果顯示,血漿miR-769-5p 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的AUC 為0.92,靈敏度為88.42%(95%CI:80.23%-94.08%),特異度為73.68%(95%CI:63.65%-82.19%),cut-off 值為4.85(miRNA/let-7)。血漿miR-320a 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的AUC 為0.84,靈敏度為80.00%(95%CI:70.54%-87.51%),特異度為78.95%(95%CI:69.38%-86.64%),cut-off 值為506.5(miRNA/let-7)。血漿miR-22-3p 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的AUC 為0.70,靈敏度為63.16%(95%CI:52.64%-72.83%), 特 異 度 為68.42%(95% CI:58.08% -77.58%),cut-off 值為0.39(miRNA/let-7),見圖1。
研究顯示,人血清和血漿中的miRNA 相對穩(wěn)定[8-9]。血漿miRNA 不僅來自循環(huán)血細胞,還來自其他受疾病影響的組織[10]。此外,在各種細胞類型的微泡中也存在miRNA[11]。由此說明,細胞的主動分泌是血清和血漿中發(fā)現(xiàn)的miRNA 的主要來源,也進一步支持了血清和血漿miRNA 譜是生物學(xué)功能指標的假設(shè)。對血漿和血清miRNA 表達模式的廣泛研究可能有助于建立與組織中的病理過程相關(guān)的miRNA譜,并評估可能有助于理解疾病機制的循環(huán)miRNA。
研究者發(fā)現(xiàn),結(jié)核病患者miR-769-5p 的表達水平低于健康人,與本研究結(jié)果一致[12]。研究顯示,在MCF-7 乳腺癌細胞復(fù)氧后,miR-769-3p 降低N-myc下游調(diào)節(jié)基因1 的表達,而miR-769-3p 的過表達會增強細胞凋亡[13]。此外,miR-769-5p 可與其它miRNAs聯(lián)合應(yīng)用于胰腺癌和非小細胞肺癌的預(yù)后[14]。本研究發(fā)現(xiàn),肺結(jié)核患者血漿miR-320a 表達下調(diào),與Cui等[12]研究結(jié)果一致。目前其機制并不清楚,筆者推測miR-320a 表達降低可通過重新激活肺組織中的細胞遷移和增殖來促進疾病的進展。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),相比健康對照組,肺結(jié)核患者血漿中的miR-22-3p 水平下調(diào)。研究顯示,miR-22 通過磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)3'UTR 上的特定位點直接下調(diào)磷酸酶和張力蛋白同源物水平,并通過微調(diào)PTEN/AKT/FoxO1 途徑的動力學(xué)起作用[15]。在內(nèi)皮細胞中,細胞外尿苷三磷酸(UTP)和三磷酸腺苷(ATP)通過miR-22 減弱細胞間黏附分子1(ICAM-1)的表達和白細胞黏附[16]。為了理解miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 在結(jié)核病患者中獨特表達模式的重要性,需進一步研究這些miRNA,以鑒定循環(huán)miRNA的靶基因及其機制,通過調(diào)控miRNAs 的表達來控制和預(yù)防病情的發(fā)展。
圖1 ROC 曲線診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核疾病
本研究結(jié)果顯示,血漿miR-769-5p 水平診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核的AUC 高達0.92,且靈敏度為88.42%,特異度為73.68%,從中可以看出血漿miR-769-5p 具有較高的診斷價值。同時,我們還分析了血漿miR-320a 水平,結(jié)果顯示診斷肺結(jié)核的AUC 為0.84,敏感度和特異度分別為80.00%和78.95%,也具有較高的診斷價值。另外,血漿miR-22-3p 也顯示出了較高的診斷價值,AUC 達到0.70,靈敏度和特異度均超過了60%。由于本研究樣本量較少,可能存在較大誤差,因此需要進一步擴大樣本量進行驗證。
綜上所述,血漿游離miR-769-5p、miR-320a 和miR-22-3p 對于預(yù)防和診斷結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核可能具有潛在的應(yīng)用價值。