馮 珺 周 峰 周紅琴 蔡鑫君 王 增

去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是一種無色結(jié)晶性粉末，易溶于水，是新型抗癌藥物，用于治療原發(fā)性肝癌、骨髓瘤、消化道腫瘤等，療效顯著，還具有保護肝細胞、調(diào)節(jié)機體免疫力、升高白細胞的功能[1-4]。然而，該藥具有一定的臟器毒性，從而限制了NCTD 在臨床上的應用[5]。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇為膜材構成的微型泡囊體，作為藥物載體在惡性腫瘤的靶向給藥治療方面極具潛力。脂質(zhì)體可通過藥物與細胞的相互作用，顯著提高藥物對腫瘤細胞的抑制和殺傷作用。本研究以磷脂和膽固醇為主要材料制備去甲斑蝥素脂質(zhì)體，并采用高效液相（HPLC）法建立去甲斑蝥素脂質(zhì)體的含量測定方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（1260Ⅱ型，Agilent 公司）；色譜柱（Agilent C18：150mm×4.6mm，4μm；安捷倫科技有限公司）；電子天平（CP225D 型，北京賽多利斯儀器有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-250DB 型，昆山市超聲儀器有限公司）；超聲波細胞粉碎機（SCIENTZ-Ⅱ型，寧波新芝生物科技股份有限公司）；去甲斑蝥素原料藥（湖北省武漢東康源科技有限公司，批號20161101，純度≥98%）；去甲斑蝥素脂質(zhì)體（自制，批號201708）；去甲斑蝥素對照品（中國食品藥品檢定研究院）。

2 脂質(zhì)體的制備

根據(jù)參考文獻采用薄膜分散法制備去甲斑蝥素脂質(zhì)體[6]。按質(zhì)量比2：1 稱取一定量的磷脂和膽固醇置于燒杯中，加入適量氯仿，超聲溶解。將混合溶液置于圓底燒瓶中，在37℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，待混合溶液在燒瓶壁上成膜后，加入pH6.8 含去甲斑蝥素的磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)水合20min，將上述混合液繼續(xù)磁力攪拌20min，再用探頭短時超聲（功率：270W；間歇超聲：1s/1s）5min，即得脂質(zhì)體。

3 含量測定

3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18 （150mm×4.6mm，4μm）；流動相：乙腈-pH3.1 磷酸水溶液（10∶90）；流速0.8mL/min；檢測波長210nm；柱溫25℃；進樣量20μL。

3.2 溶液制備 對照品溶液制備：精密稱取去甲斑蝥素對照品約10mg，置于10mL 容量瓶中，加入流動相溶解并稀釋至刻度定容。樣品溶液制備：制備含藥脂質(zhì)體，并加入適量流動相超聲破乳后，再加入流動相稀釋定容至刻度，過膜，即得?？瞻兹芤褐苽洌喊凑諛悠啡芤旱闹苽浞椒?，但不加入去甲斑蝥素，即得。

3.3 方法學考察

3.3.1 專屬性試驗 分別取去甲斑蝥素對照品溶液、去甲斑蝥素脂質(zhì)體溶液及空白脂質(zhì)體溶液適量，以“3.1”項下條件進樣操作，記錄色譜圖。結(jié)果顯示去甲斑蝥素脂質(zhì)體溶液主峰的保留時間（4.4min 左右）與對照品溶液主峰保留時間一直，表明去甲斑蝥素脂質(zhì)體的輔料對去甲斑蝥素測定無影響，方法專屬性良好。見圖1。

3.3.2 線性與范圍 精密量取去甲斑蝥素對照品儲備液適量，用流動相稀釋成濃度分別為：9.18，45.90，91.80，137.70，183.60，459.00μg/mL 的 去甲斑蝥素對照品溶液。照上述條件操作，以去甲斑蝥素濃度（C）對吸收峰面積（A）做回歸方程，得到回歸方程為：A=1.5373C-5.0423，r=0.999，結(jié)果表明在9.18～459.00μg/mL 范圍內(nèi)去甲斑蝥素濃度與峰面積具有較好的線性關系。

3.3.3 精密度試驗 精密移取去甲斑蝥素對照品儲備溶液，配制成濃度分別為459、91.8、9.18μg/mL 的去甲斑蝥素溶液，按上述方法測定，每個濃度日內(nèi)測定3 次，計算日內(nèi)精密度相對標準差（RSD），分別為0.13%、0.54%、0.65%。由結(jié)果可知，精密度均符合方法學要求。

圖1 去甲斑蝥素色譜圖

3.3.4 重復性試驗 取同一批制備的去甲斑蝥素脂質(zhì)體6 份，依“3.2”項下方法處理樣品，照“3.1”項下條件進樣，記錄峰面積，去甲斑蝥素濃度RSD=1.52%（n=6）

3.3.5 加樣回收率試驗 精密量取空白脂質(zhì)體1mL置于10mL 容量瓶中，加入去甲斑蝥素對照品儲備液0.5、0.3、0.1mL，各3 份，加入適量流動相超聲破乳后，再用流動相稀釋定容至刻度，過0.22μm 微孔濾膜，即得供試溶液。照“3.1”項下條件進樣，記錄峰面積，計算去甲斑蝥素濃度，與實際去甲斑蝥素濃度相比得到加樣回收率，所得到的平均加樣回收率在98.87%～100.31%，各組的RSD 滿足含量測定要求，見表1。

表1 去甲斑蝥素脂質(zhì)體的加樣回收試驗結(jié)果

3.4 脂質(zhì)體包封率的測定 按前期課題組預實驗和參考文獻測定脂質(zhì)體包封率[7]，精密量取1mL 去甲斑蝥素脂質(zhì)體適量置于10mL 容量瓶中，加入適量流動相超聲破乳后，再用流動相稀釋定容至刻度，混勻后過0.22μm 的濾膜，按上述色譜條件進樣，檢測去甲斑蝥素峰面積，代入回歸方程，計算去甲斑蝥素總量（C 總）；精密取去甲斑蝥素脂質(zhì)體適量置于離心管中，高速離心（15000r/min）30min，取上清液1mL 置于10mL 容量瓶中，再用流動相稀釋定容至刻度，混勻后過0.22μm 的濾膜，按上述色譜條件進樣，檢測去甲斑蝥素峰面積，代入回歸方程，計算游離的去甲斑蝥素（C 游），包封率=（C 總-C 游）/C 總×100%。計算得到去甲斑蝥素脂質(zhì)體的包封率為25.53%。

4 討 論

去甲斑蝥素是從斑蝥中提取并人工合成的一種新型抗癌藥物。雖然毒性比其他斑蝥素低，但還是具有一定的毒性，并且在水中的溶解度較差，生物利用度也較低。因此，為了更好地發(fā)揮去甲斑蝥素的抗腫瘤活性，本研究將去甲斑蝥素制備成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體作為一種藥物載體，具有靶向性、長效性，能降低藥物毒性、提高藥物的穩(wěn)定性。去甲斑蝥素脂質(zhì)體可以使藥物劑量減少，毒性降低，腎毒性降低。

脂質(zhì)體的制備方法有注入法、薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法和冷凍干燥法等。本研究中的脂質(zhì)體采用薄膜分散法制備，制備工藝簡單，易于操作。本研究脂質(zhì)體中包封率測定采用離心法，利用游離藥物與含藥脂質(zhì)體的重力差異進行分離，計算包封率。但離心法需要將脂質(zhì)體長時間暴露于高速離心機中，離心力會導致脂質(zhì)體中藥物的滲漏，因此藥物的包封率不高。另外脂質(zhì)體溶解度大，其形成時內(nèi)外水相中的藥物可迅速達到平衡，導致包封率偏低。

包封率是脂質(zhì)體研究的主要內(nèi)容，提高包封率一直是脂質(zhì)體研究中的熱點和難點。隨著對脂質(zhì)體研究的深入，針對脂質(zhì)體包封率影響因素，研究人員設計出幾種提高包封率的方法，如前體藥物法，pH梯度法等具有很高的實用性[8-10]。因此，深入研究包載過程中藥物與脂質(zhì)體膜相互作用，將成為新的技術和方法的理論依據(jù)，促進脂質(zhì)體作為藥物載體的開發(fā)和使用。