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        高效液相法測定去甲斑蝥素脂質(zhì)體的包封率

        2019-09-21 08:03:28周紅琴蔡鑫君

        馮 珺 周 峰 周紅琴 蔡鑫君 王 增

        去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)是一種無色結(jié)晶性粉末,易溶于水,是新型抗癌藥物,用于治療原發(fā)性肝癌、骨髓瘤、消化道腫瘤等,療效顯著,還具有保護肝細胞、調(diào)節(jié)機體免疫力、升高白細胞的功能[1-4]。然而,該藥具有一定的臟器毒性,從而限制了NCTD 在臨床上的應用[5]。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇為膜材構成的微型泡囊體,作為藥物載體在惡性腫瘤的靶向給藥治療方面極具潛力。脂質(zhì)體可通過藥物與細胞的相互作用,顯著提高藥物對腫瘤細胞的抑制和殺傷作用。本研究以磷脂和膽固醇為主要材料制備去甲斑蝥素脂質(zhì)體,并采用高效液相(HPLC)法建立去甲斑蝥素脂質(zhì)體的含量測定方法。

        1 儀器與試藥

        高效液相色譜儀(1260Ⅱ型,Agilent 公司);色譜柱(Agilent C18:150mm×4.6mm,4μm;安捷倫科技有限公司);電子天平(CP225D 型,北京賽多利斯儀器有限公司);數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DB 型,昆山市超聲儀器有限公司);超聲波細胞粉碎機(SCIENTZ-Ⅱ型,寧波新芝生物科技股份有限公司);去甲斑蝥素原料藥(湖北省武漢東康源科技有限公司,批號20161101,純度≥98%);去甲斑蝥素脂質(zhì)體(自制,批號201708);去甲斑蝥素對照品(中國食品藥品檢定研究院)。

        2 脂質(zhì)體的制備

        根據(jù)參考文獻采用薄膜分散法制備去甲斑蝥素脂質(zhì)體[6]。按質(zhì)量比2:1 稱取一定量的磷脂和膽固醇置于燒杯中,加入適量氯仿,超聲溶解。將混合溶液置于圓底燒瓶中,在37℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿,待混合溶液在燒瓶壁上成膜后,加入pH6.8 含去甲斑蝥素的磷酸鹽緩沖液,繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)水合20min,將上述混合液繼續(xù)磁力攪拌20min,再用探頭短時超聲(功率:270W;間歇超聲:1s/1s)5min,即得脂質(zhì)體。

        3 含量測定

        3.1 色譜條件 色譜柱:Agilent C18 (150mm×4.6mm,4μm);流動相:乙腈-pH3.1 磷酸水溶液(10∶90);流速0.8mL/min;檢測波長210nm;柱溫25℃;進樣量20μL。

        3.2 溶液制備 對照品溶液制備:精密稱取去甲斑蝥素對照品約10mg,置于10mL 容量瓶中,加入流動相溶解并稀釋至刻度定容。樣品溶液制備:制備含藥脂質(zhì)體,并加入適量流動相超聲破乳后,再加入流動相稀釋定容至刻度,過膜,即得??瞻兹芤褐苽洌喊凑諛悠啡芤旱闹苽浞椒?,但不加入去甲斑蝥素,即得。

        3.3 方法學考察

        3.3.1 專屬性試驗 分別取去甲斑蝥素對照品溶液、去甲斑蝥素脂質(zhì)體溶液及空白脂質(zhì)體溶液適量,以“3.1”項下條件進樣操作,記錄色譜圖。結(jié)果顯示去甲斑蝥素脂質(zhì)體溶液主峰的保留時間(4.4min 左右)與對照品溶液主峰保留時間一直,表明去甲斑蝥素脂質(zhì)體的輔料對去甲斑蝥素測定無影響,方法專屬性良好。見圖1。

        3.3.2 線性與范圍 精密量取去甲斑蝥素對照品儲備液適量,用流動相稀釋成濃度分別為:9.18,45.90,91.80,137.70,183.60,459.00μg/mL 的 去甲斑蝥素對照品溶液。照上述條件操作,以去甲斑蝥素濃度(C)對吸收峰面積(A)做回歸方程,得到回歸方程為:A=1.5373C-5.0423,r=0.999,結(jié)果表明在9.18~459.00μg/mL 范圍內(nèi)去甲斑蝥素濃度與峰面積具有較好的線性關系。

        3.3.3 精密度試驗 精密移取去甲斑蝥素對照品儲備溶液,配制成濃度分別為459、91.8、9.18μg/mL 的去甲斑蝥素溶液,按上述方法測定,每個濃度日內(nèi)測定3 次,計算日內(nèi)精密度相對標準差(RSD),分別為0.13%、0.54%、0.65%。由結(jié)果可知,精密度均符合方法學要求。

        圖1 去甲斑蝥素色譜圖

        3.3.4 重復性試驗 取同一批制備的去甲斑蝥素脂質(zhì)體6 份,依“3.2”項下方法處理樣品,照“3.1”項下條件進樣,記錄峰面積,去甲斑蝥素濃度RSD=1.52%(n=6)

        3.3.5 加樣回收率試驗 精密量取空白脂質(zhì)體1mL置于10mL 容量瓶中,加入去甲斑蝥素對照品儲備液0.5、0.3、0.1mL,各3 份,加入適量流動相超聲破乳后,再用流動相稀釋定容至刻度,過0.22μm 微孔濾膜,即得供試溶液。照“3.1”項下條件進樣,記錄峰面積,計算去甲斑蝥素濃度,與實際去甲斑蝥素濃度相比得到加樣回收率,所得到的平均加樣回收率在98.87%~100.31%,各組的RSD 滿足含量測定要求,見表1。

        表1 去甲斑蝥素脂質(zhì)體的加樣回收試驗結(jié)果

        3.4 脂質(zhì)體包封率的測定 按前期課題組預實驗和參考文獻測定脂質(zhì)體包封率[7],精密量取1mL 去甲斑蝥素脂質(zhì)體適量置于10mL 容量瓶中,加入適量流動相超聲破乳后,再用流動相稀釋定容至刻度,混勻后過0.22μm 的濾膜,按上述色譜條件進樣,檢測去甲斑蝥素峰面積,代入回歸方程,計算去甲斑蝥素總量(C 總);精密取去甲斑蝥素脂質(zhì)體適量置于離心管中,高速離心(15000r/min)30min,取上清液1mL 置于10mL 容量瓶中,再用流動相稀釋定容至刻度,混勻后過0.22μm 的濾膜,按上述色譜條件進樣,檢測去甲斑蝥素峰面積,代入回歸方程,計算游離的去甲斑蝥素(C 游),包封率=(C 總-C 游)/C 總×100%。計算得到去甲斑蝥素脂質(zhì)體的包封率為25.53%。

        4 討 論

        去甲斑蝥素是從斑蝥中提取并人工合成的一種新型抗癌藥物。雖然毒性比其他斑蝥素低,但還是具有一定的毒性,并且在水中的溶解度較差,生物利用度也較低。因此,為了更好地發(fā)揮去甲斑蝥素的抗腫瘤活性,本研究將去甲斑蝥素制備成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體作為一種藥物載體,具有靶向性、長效性,能降低藥物毒性、提高藥物的穩(wěn)定性。去甲斑蝥素脂質(zhì)體可以使藥物劑量減少,毒性降低,腎毒性降低。

        脂質(zhì)體的制備方法有注入法、薄膜分散法、逆相蒸發(fā)法和冷凍干燥法等。本研究中的脂質(zhì)體采用薄膜分散法制備,制備工藝簡單,易于操作。本研究脂質(zhì)體中包封率測定采用離心法,利用游離藥物與含藥脂質(zhì)體的重力差異進行分離,計算包封率。但離心法需要將脂質(zhì)體長時間暴露于高速離心機中,離心力會導致脂質(zhì)體中藥物的滲漏,因此藥物的包封率不高。另外脂質(zhì)體溶解度大,其形成時內(nèi)外水相中的藥物可迅速達到平衡,導致包封率偏低。

        包封率是脂質(zhì)體研究的主要內(nèi)容,提高包封率一直是脂質(zhì)體研究中的熱點和難點。隨著對脂質(zhì)體研究的深入,針對脂質(zhì)體包封率影響因素,研究人員設計出幾種提高包封率的方法,如前體藥物法,pH梯度法等具有很高的實用性[8-10]。因此,深入研究包載過程中藥物與脂質(zhì)體膜相互作用,將成為新的技術和方法的理論依據(jù),促進脂質(zhì)體作為藥物載體的開發(fā)和使用。

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