朱雅琳 聶晶 帕麗達·阿布利孜

[摘要]目的：從分子生物學水平探討強脈沖光和長脈寬1 064nm Nd：YAG激光治療血管瘤的機制。方法：使用不同能量強脈沖光和長脈寬1 064nm Nd：YAG激光對嬰兒血管瘤血管內皮細胞進行體外照射，照射后測量不同時間點細胞OD值，并進行比較。結果：強脈沖光組照射后，在同一時間點能量越高，體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞OD值越低，表明照射后存活細胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在所有測試時間點均呈現(xiàn)相同的改變趨勢。Nd：YAG組照射后，在同一時間點，不同能量顯示相同的變化趨勢。在同一能量組，不同時間點的變化趨勢有所不同。結論：強脈沖光和Nd：YAG激光對于血管瘤的抑制作用除了“選擇性光熱作用”外，還通過影響血管瘤內皮細胞的生長發(fā)揮抑制作用，并且影響程度在一定范圍內受到能量和時間的影響。

[關鍵詞]強脈沖光;Nd：YAG激光;嬰兒血管瘤;內皮細胞;體外培養(yǎng);生長曲線

[中圖分類號]R732.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）09-0096-06

1983年Anderson和Parish提出了“選擇性光熱作用”理論[1-2]，對激光的臨床應用起到革命性的作用。此后激光成功用于血管瘤的治療中，并取得明顯成效。激光將血液加熱到70℃左右導致血管的不可逆性破壞，從而達到治療目的。強脈沖光源是由高能量的閃光燈激發(fā)出波長515～1 200nm的非相干光，也通過“選擇性光熱作用原理”對血管瘤發(fā)揮治療作用，可變脈寬1 064nm Nd：YAG激光在嬰兒血管瘤的治療中也取得較好的臨床應用[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)普萘洛爾對體外培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內皮細胞的生長有明顯抑制作用，同時對相關生長因子、β-腎上腺素受體及細胞凋亡均有影響[4-10]，那么強脈沖光和激光除了通過“選擇性光熱作用原理”起到治療嬰兒淺表血管瘤的作用外，是否通過影響血管內皮細胞生長活性而起到治療作用，還有待研究。本研究擬通過對體外培養(yǎng)的血管瘤內皮細胞進行強脈沖光和長脈寬1 064nm Nd：YAG激光照射，分別觀察照射前后血管瘤內皮生長曲線及形態(tài)學的變化，從分子生物學水平探討強脈沖光和長脈寬1 064nm Nd：YAG激光治療血管瘤的機制。

1? 材料和方法

1.1 實驗材料：嬰兒血管瘤內皮細胞來源于前期實驗原代培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內皮細胞，實驗經(jīng)過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會的倫理審查，并且體外培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內皮細胞經(jīng)過免疫組化進行鑒定，進行了純度測定（為75%）。

1.2 主要試劑：胎牛血清（FBS）（美國Life technologies公司，16000044）;EGM-2（CC-4176，Lonza）;0.25%胰酶（Trypsin-EDTA）（25200-056，Gibco）;PBS磷酸鹽緩沖液粉劑（ZLI-9062，北京中杉金橋生物）;青霉素-鏈霉素雙抗（10000U）（SC30010，Gibco）;CCK-8試劑（FC101-03，北京全式金生物）

1.3 方法

1.3.1 試劑配制：2%血清EGM-2完全培養(yǎng)基：500ml的EGM-2培養(yǎng)基中含10ml胎牛血清、0.2ml醋酸氫化可的松、hFGF-b 2ml、VEGF 2ml、R3-IGF-1 0.5ml、抗壞血酸0.5ml、hEGF 0.5ml、GA-1000 0.5ml、肝素0.5ml，添加1ml的青-鏈霉素雙抗溶液。10% DMSO細胞凍存液：0.1ml的DMSO溶液加入0.9ml的完全培養(yǎng)基中。10% CCK-8溶液配制：按照CCK-8與完全培養(yǎng)基1：9比例配制10% CCK-8檢測溶液。

1.3.2 細胞準備：從液氮中取出凍存的前期實驗進行原代培養(yǎng)并鑒定的血管瘤內皮細胞，進行復蘇及傳代。當培養(yǎng)瓶（25cm2）中細胞貼壁融合達80%時，即可進行細胞的傳代。取生長狀態(tài)良好的細胞，完全培養(yǎng)基制備成0.2～1×105 cells/ml單細胞懸液，每隔24h接種至96孔板中（100μl/孔，6個復孔，即0.2～1×104個細胞/孔）。8d后小心吸干凈細胞培養(yǎng)基，加入配置好的10% CCK-8溶液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育，1～4h后酶標儀450nm波長檢測OD值。（取合適的檢測時間OD值進行計算，一般選取OD值為1～2的值進行計算）。繪制生長曲線，確定細胞株的對數(shù)生長期，用于后續(xù)實驗。

1.3.3 不同能量激光照射體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞：共分為七組。

1.3.3.1 激光分組照射情況：空白對照組：不照射，只使用2%血清EGM-2完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。強脈沖光照射組（intense pulsed light）：照射波長為560nm，雙脈沖，脈寬3.5ms，脈沖間隔20ms，其中A組照射能量為23J/cm2，B組為24J/cm2，C組為25J/cm2。激光照射組（l 064nm Nd：YAG激光）：照射波長1 064nm，單脈沖，脈沖持續(xù)時間11.5ms，其中A組能量為90J/cm2，B組為100J/cm2，C組為110J/cm2。

1.3.3.2 細胞培養(yǎng)：取生長狀態(tài)良好的細胞，用完全培養(yǎng)基制備成0.2～1×105 cells/ml單細胞懸液，接種至96孔板中（100μl/孔，5個復孔，即0.2～1×104個細胞/孔）。2種照射方式、每組7個檢測時間段、每個時間段5個重復，共加7個96孔板，標記好光照能量和檢測時間段，將96孔板放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后將96孔板按1.3.3.1中的激光能量分組照射，空白對照組不進行照射。照射后將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞活力：照射后第1、2、3、4、7、14、21天用CCK-8法檢測細胞活力。小心吸干凈對應時間段小孔中的細胞培養(yǎng)基，每孔加入配置好的100μl 10% CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中37℃孵育1～4h，450nm波長檢測OD值。以時間為橫坐標，平均OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

2? 結果

2.1 細胞生長曲線繪制結果：結果顯示第1～2天細胞吸光度平均值增長緩慢，第2～4天迅速增長，第5天輕度下降，第6～7天達到平臺期。與文獻報道一致[3]。見圖1。

2.2 CCK-8檢測結果：不同能量強脈沖光及l(fā) 064nm Nd：YAG照射體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞后，不同時間點使用CCK-8法測定細胞OD值。

2.2.1 強脈沖光照射：強脈沖光560nm，雙脈沖，脈寬3.5ms，脈沖間隔20ms，能量分別為23、24、25J/cm2進行照射，照射后第1、2、3、4、7、14、21d用CCK-8法檢測每組細胞OD值發(fā)現(xiàn)，在同一時間點，能量越高，體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞OD值越低，提示經(jīng)過照射后生存的細胞減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;并且在所有的測試時間點均呈現(xiàn)相同的改變趨勢。而在同一能量組，空白組的變化與體外培養(yǎng)血管瘤內皮細胞的生長曲線吻合，而23J/cm2照射組照射后第2～3天較第1天OD值有明顯變化，第4、7、21天OD值明顯下降，較第2、3天均下降，但4、7、21d間并無差異;24J/cm2照射組則有所不同，在照射第2、3、4、7天的OD值變化不大，第14、21天OD值明顯下降。25J/cm2照射組照射后OD值隨時間變化不大（P>0.05）。多因素方差分析后顯示激光能量及時間均是細胞OD值的影響因素（P<0.05）。見表1。

2.2.2 不同Nd：YAG激光照射：在同一時間點，不同能量顯示相同的變化趨勢，90J/cm2照射組較空白組OD值有所變化，100J/cm2較空白組和90J/cm2照射組的OD值均有下降，而110J/cm2組較100J/cm2組OD值沒有明顯變化。在同一能量組，不同時間點的變化趨勢有所不同，90J/cm2組照射后第2、3、4、7、14、21天的OD值較第1天均有變化，但隨時間變化，OD值變化不大，在100J/cm2組OD值較空白組的OD值是下降的，隨時間延長細胞的OD值也是逐漸下降的。見表2。

2.3 細胞形態(tài)學變化

2.3.1 空白組：血管瘤內皮細胞經(jīng)傳代24h后觀察，細胞逐漸貼壁，呈類圓形至多角形。生長2～3d后，數(shù)量逐漸增多。4～5d細胞逐漸融合，呈多角形，隨后細胞逐漸成梭形及條索行，部分可見有類似血管結構形成。見圖2。

2.3.2 照射后細胞形態(tài)變化情況：體外培養(yǎng)的血管瘤內皮細胞經(jīng)不同激光照射后，細胞形態(tài)較前有所改變，細胞形態(tài)較前纖細，細胞間距增大，細胞變稀疏，見圖3～4。

3? 討論

目前多認為激光治療嬰兒血管瘤的機制為“選擇性光熱作用原理”[1]，但隨著嬰幼兒血管瘤發(fā)病機制研究的深入，尤其是前期研究發(fā)現(xiàn)血管內皮細胞生長因子等的變化在血管瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起重要作用[4-6，11-15]，因此猜想激光治療嬰兒血管瘤的機制并不局限于“選擇性光熱作用原理”，激光同時對血管瘤內皮細胞生長的細胞因子有著重要的影響作用。

本研究發(fā)現(xiàn)強脈沖光（560nm，雙脈沖，脈寬3.5ms，脈沖間隔20ms）和1 064nm激光對體外培養(yǎng)的血管瘤內皮細胞的生長是有影響的。在不同能量組，不同時間點體外培養(yǎng)的血管瘤內皮細胞形態(tài)學有所改變，隨著照射時間的延長，細胞間距增大，變稀疏，說明細胞生長繁殖受到抑制。其次，對細胞的OD值進行檢測發(fā)現(xiàn)，兩種激光干預均可降低細胞的OD值，并且在一定能量范圍內隨著能量的升高，OD值降低越明顯，說明對細胞的抑制作用越明顯，并且隨著治療時間的延長，OD值在進一步下降。

強脈沖光照射各能量組在第21天時OD值較第14天變化不大（P>0.05），在25J/cm2照射組，隨著時間的變化，細胞OD值較其他能量組變化不大，而其他各組隨著能量增加以及治療時間的延長，OD值均降低，提示強脈沖光照射后血管瘤內皮細胞的數(shù)量減少，生長被抑制，因此考慮強脈沖光對體外培養(yǎng)的嬰兒血管瘤內皮細胞有抑制作用，其對血管瘤的治療作用不僅僅是通過“選擇性光熱作用原理”，也通過抑制細胞的生長而發(fā)揮作用。并且在一定范圍內（<25J/cm2）能量越高，抑制作用越強，治療后一定時間內（21d），血管瘤內皮細胞呈現(xiàn)持續(xù)被抑制的現(xiàn)象，因此推測激光治療后，除了血紅蛋白吸收激光能量，加熱血管，使血管閉鎖破壞，同時強脈沖光在治療一段時間內對血管瘤內皮細胞有持續(xù)抑制作用，但是強脈沖光抑制細胞生長的具體機制還有待進一步研究。但此結論提示在臨床治療中，為達到更好的臨床療效，在一定范圍內可提高治療能量，但不能無限制提高，否則副作用出現(xiàn)增多，且并不能提高療效，其次治療一段時間后，激光對細胞的抑制作用減弱，可再次進行治療，本實驗發(fā)現(xiàn)21d后，強脈沖光組細胞OD值下降不明顯，因此可以將此時間作為治療間隔的參考時間。

Nd：YAG照射組（波長1 064nm，單脈沖，脈沖持續(xù)時間11.5ms）：隨著照射后時間的延長，鏡下觀察發(fā)現(xiàn) 細胞間距增大，變稀疏，說明細胞生長繁殖受到抑制。在不同能量組間90～100J/cm2較空白組的OD值變化明顯，說明細胞的生長受到抑制，而更高能量組（110J/cm2）則并沒有顯示出更大的抑制作用，而同一能量組在21d之內，隨著時間延長，在110J/cm2組，細胞的生長呈下降趨勢，而其他組則沒有明顯的變化趨勢，但通過多因素方差分析后，時間和能量均是細胞活性的影響因素（P<0.05）。

綜上所述，強脈沖光和長脈寬Nd：YAG激光對于體外培養(yǎng)嬰兒血管瘤內皮細胞的生長是有影響的，這說明強脈沖光和Nd：YAG激光對于血管瘤的抑制作用除了“選擇性光熱作用”之外，還通過影響血管瘤內皮細胞的生長起到抑制作用，并且影響程度在一定范圍內受到能量和時間的影響。因此提示在臨床治療過程中，在一定范圍內可適當加大治療劑量以提高療效，也應避免過高能量引起不良反應。其次，激光治療后一定時間內細胞呈持續(xù)抑制作用，但在一段時間后（21d），抑制作用呈減弱趨勢，提示治療可在一定時間內重復進行，但臨床使用還需要進一步觀察研究。例如治療需要間隔，給予血管瘤內皮細胞生長恢復的時間。強脈沖光和Nd：YAG激光的這一作用機制目前尚不清楚，根據(jù)目前文獻報道及研究考慮與細胞生長因子，信號通路有關，這還需要進一步的研究。嬰兒血管瘤的發(fā)病機制研究并不透徹，但目前的研究顯示，血管瘤發(fā)病機制是多環(huán)節(jié)，多靶點的，因此提示嬰兒血管瘤的治療除目前的治療方法外，可嘗試多環(huán)節(jié)多靶點的治療，并可考慮綜合治療，以提高血管瘤的治療療效。

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[收稿日期]2018-12-27

本文引用格式：朱雅琳，聶晶，帕麗達·阿布利孜.強脈沖光與長脈寬Nd：YAG激光對嬰幼兒血管瘤內皮細胞活性的影響[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（9）：96-101.