袁林， 賈化可， 盛淼淼， 王兵， 曾麗娜， 劉紅美，隆耀航**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心,貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025；3.貴州省教育廳 免疫細(xì)胞與抗體工程研究中心,貴州 貴陽 550025； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

在微生物生命活動中，鐵元素參與多種生化代謝過程。鐵在地殼中含量較多，但多以Fe(OH)3形式存在，溶解性差，很難被生物吸收利用[1-2]，因此微生物進(jìn)化過程中形成了多種途徑來獲取鐵，合成嗜鐵素(Siderophore)就是其中一種非常重要的途徑[3-6]。嗜鐵素是微生物在低鐵或缺鐵應(yīng)激條件下合成的一種能夠高效結(jié)合Fe3+、并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的小分子有機(jī)化合物[7]。短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)是革蘭陽性菌，有較強(qiáng)蛋白分泌能力，是一種產(chǎn)芽孢的生物防治菌[8-12]。短短芽孢桿菌GZDF3從半夏根際土壤分離獲得[13]，該菌株對半夏病原菌及多種其它病原菌均具有較強(qiáng)的拮抗作用，在植物病蟲害的防治上具有較好的應(yīng)用前景，其抗菌成分值得深入研究[14]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)GZDF3基因組中沒有與Bacillibactin嗜鐵素合成基因簇相似的基因簇，但存在一個(gè)與Petrobactin嗜鐵素相似性高達(dá)83%的合成基因簇。Petrobactin嗜鐵素合成基因簇asbABCDEF，分別與短短芽孢桿菌GZDF3的Gene5689、Gene5690、Gene5691、Gene5692、Gene5693、Gene5694的6個(gè)基因相對應(yīng)[15]。目前Petrobactin嗜鐵素相關(guān)研究多集中于炭疽芽孢桿菌。2004年，有學(xué)者通過定向基因敲除研究了asbA基因的功能，缺鐵條件下，asbA缺失突變體表現(xiàn)為嗜鐵素產(chǎn)量降低，長勢變?nèi)鮗16]。而且，asbA缺失突變體對老鼠的致病力也顯著降低[16]，Nusca等[17]利用檸檬酸、亞精胺、3，4-二羥基苯甲酸底物成功實(shí)現(xiàn)了Petrobactin嗜鐵素的異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AsbA合成酶的功能可以由AsbB進(jìn)行補(bǔ)償，即缺失AsbA合成酶，其余5個(gè)基因也能合成部分Petrobactin；但是asbE基因缺失，不能合成Petrobactin嗜鐵素，意味著asbE基因是Petrobactin嗜鐵素合成途徑中的關(guān)鍵基因。目前，已經(jīng)對Petrobactin嗜鐵素合成基因簇中的asbB[12]、asbD[13]、asbF[14]進(jìn)行了功能與結(jié)構(gòu)研究。但對短短芽孢桿菌嗜鐵素的研究尚未見報(bào)道，因此，基于asbE在嗜鐵素合成過程中的重要作用，本研究對短短芽孢桿菌GZDF3菌株P(guān)etrobactin嗜鐵素合成基因Gene5693(asbE)進(jìn)行分析，為后續(xù)嗜鐵素合成基因簇的功能及體外合成研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

pET-28a質(zhì)粒的菌種由本課題組保存；表達(dá)菌株BL21由生物與工程學(xué)院王兵副教授饋贈；短短芽孢桿菌GZDF3由本課題組分離獲得，其全基因組序列登錄號LVYG00000000。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 (1)嗜鐵素合成酶蛋白的預(yù)測，在AntiSMASH(http://antismash.secondarymetabolites.org/)軟件里輸入短短芽孢桿菌GZDF3全基因組序列(登錄號LVYG00000000)，利用AntiSMASH(Ver 3.0.5)預(yù)測其代謝產(chǎn)物合成基因簇[18]；利用序列分析軟件BioEdit7.0.9.0構(gòu)建本地短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)GZDF3蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，以NCBI中檢索到的asbE(登錄號WP_132131835)蛋白質(zhì)序列作先導(dǎo)序列， blastp搜索BrevibacillusbrevisGZDF3本地蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫；(2)嗜鐵素合成酶蛋白基本性質(zhì)分析，用ExPASy(http://www.expasy.org/)分析預(yù)測嗜鐵素合成酶蛋白的等電點(diǎn)(pI)和相對分子質(zhì)量(MW)、親水性及疏水性，用TMpred軟件進(jìn)行跨膜區(qū)域分析，用SignalP進(jìn)行信號肽分析。

1.2.2引物設(shè)計(jì) 利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)目的基因的引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物序列為 5′-CGTGGATCCATGGTTAAGGTTC-3′，下游引物序列為5′-CGTAAGCTTTTACCTCCACCC-3′，其中下劃部分分別為BamHⅠ和Hind Ⅲ酶的識別切割位點(diǎn)。

1.2.3目的基因的擴(kuò)增及純化 從-80 ℃冰箱取出菌種GZDF3劃線培養(yǎng)，從過夜培養(yǎng)的平板中挑取邊緣清晰的單菌落放入LB液體培養(yǎng)基中，在搖床中37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟，提取GZDF3菌株的基因組；以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用3 mol/L NaAc和無水乙醇進(jìn)行純化。

1.2.4重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將含有pET-28a質(zhì)粒的E·coli接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，使用OMEGA公司Plasmid Mini KIT按說明書提取pET-28a質(zhì)粒并純化；將純化后的PCR產(chǎn)物Gene5693與pET-28a質(zhì)粒用酶BamHⅠ和Hind Ⅲ 酶切，隨后電泳檢測并回收酶切產(chǎn)物，16 ℃連接過夜；將連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取5～10個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，選取電泳條帶大小與目的基因一致的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行雙酶切鑒定，將經(jīng)菌落PCR 和雙酶切鑒定的菌液保存并送深圳華大基因進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.5重組DNA分子的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化 (1)重組DNA分子的誘導(dǎo)表達(dá)，將過夜培養(yǎng)的菌液以1% 的接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5左右，取1 mL作為誘導(dǎo)前對照；加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，于30 ℃ 培養(yǎng)4 h；將誘導(dǎo)表達(dá)后菌液低溫離心10 min，取上清1 mL作為誘導(dǎo)后對照；將離心后菌體用適量PBS溶液進(jìn)行重懸，在冰水浴中進(jìn)行超聲破碎，破碎后離心收集上清；將誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后，破碎后的樣品與蛋白上樣緩沖液按4 ∶1混合，煮沸并冷卻后點(diǎn)樣；通過考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后觀察重組蛋白的表達(dá)情況。(2)表達(dá)產(chǎn)物的純化，將誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行菌體超聲破碎后離心收集的上清，通過Ni-NTA.His純化柱進(jìn)行純化，加入洗雜液，收集液體B1、B2、B3(雜蛋白)；加入洗脫液，收集洗脫液為C1、C2、C3(目的蛋白)；將目的蛋白通過SDS-PAGE電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 嗜鐵素合成酶的生物信息學(xué)分析

結(jié)果顯示，短短芽孢桿菌GZDF3基因組中存在多種編碼次級代謝產(chǎn)物的基因簇，其中一種基因簇編碼產(chǎn)物為嗜鐵素，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的Petrobactin嗜鐵素相似性達(dá)83%。以炭疽芽孢桿菌Petrobactin嗜鐵素生物合成基因asbE(NCBI登錄號WP_132131835 )與本地GZDF3蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)其與短短芽孢桿菌基因組的Gene5693基因相對應(yīng)，通過DNAMAN中的多序列比對結(jié)果如圖1A所示，發(fā)現(xiàn)Gene5693與AsbE蛋白的氨基酸序列一致性達(dá)到51.06%。

2.2 嗜鐵素合成酶Gene5693的基本性質(zhì)

利用ExpASy數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)ProtParam分析，發(fā)現(xiàn)嗜鐵素合成酶基因Gene5693所編碼氨基酸的分子式為C1787H2719N439O511S16，長度為327個(gè)氨基酸；分子量為39.05 kDa，理論等電點(diǎn)pI=4.94，為酸性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)為38.04，半衰期為30 h，可初步判定為穩(wěn)定蛋白。Gene5693有40個(gè)正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)，57個(gè)負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)，脂肪系數(shù)為88.23；親水性預(yù)測結(jié)果如圖1B所示，平均親水性為-0.336，初步判定Gene5693蛋白是親水性蛋白質(zhì)，不含有信號肽和跨膜區(qū)域。

注：A為Gene5693與asbE的序列比對結(jié)果，B為Gene5693蛋白的親疏性分析。圖1 Gene5693與asbE的序列比對及蛋白的親疏性結(jié)果Fig.1 The alignment between Gene5693 and asbE sequences

2.3 目的基因擴(kuò)增和酶切

以 GZDF3菌株的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的基因Gene5693，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2A，在1 000 bp處有一條特別明亮的條帶，大小與預(yù)測的相符。

2.4 重組DNA分子的篩選與鑒定

2.4.1菌落PCR鑒定 菌落PCR鑒定結(jié)果如圖2B所示，泳道1～5在1 000 bp處都有明亮的條帶，與泳道6(陽性對照)大小一致，初步確定Gene5693基因成功連接到質(zhì)粒上并轉(zhuǎn)化成功。

2.4.2雙酶切鑒定及測序驗(yàn)證 將經(jīng)菌落PCR檢測陽性的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切后電泳結(jié)果如圖2C，泳道1～5為重組質(zhì)粒雙酶切后電泳條帶，其兩條片段大小分別與空載體pET-28a(泳道6)和Gene5693基因(泳道7)一致，表明Gene5693基因成功連接到載體pET-28a上；同時(shí)，測序結(jié)果經(jīng)比對分析表明克隆序列與原序列相同，沒有發(fā)生突變，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。

注：M:DL2000 Marker，A為Gene5693基因的PCR擴(kuò)增、1為PCR產(chǎn)物，B為菌落PCR、1～5為隨機(jī)挑選的單菌落、6為陽性對照、7為陰性對照，C為重組DNA分子的雙酶切、1～5為質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物、6為pET-28a、7為酶切后的Gene5693。圖2 Gene5693基因的PCR擴(kuò)增、菌落PCR及重組DNA分子的雙酶切電泳結(jié)果Fig.2 Amplification ,colony PCR and double enzymatic digestion of recombinant of Gene5693

2.4.3嗜鐵素合成酶Gene5693的原核表達(dá)及純化 將菌株接種于含0.1 mol/L IPTG的培養(yǎng)基中，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，誘導(dǎo)前后上清(泳道1～2)均無目的條帶，誘導(dǎo)表達(dá)破碎后上清(泳道3～4)含目的條帶。進(jìn)一步純化后的目的蛋白(泳道5～8)與預(yù)測的理論大小(39.05 kD)一致。

注：M為Marker，1為誘導(dǎo)前上清，2為誘導(dǎo)后上清，3～4為誘導(dǎo)破碎上清， 5～8為純化后的目的蛋白。圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測Fig.3 The expression of amplified Gene5693

3 討論

嗜鐵素作為微生物次級代謝產(chǎn)物的其中一種，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)及環(huán)境保護(hù)中都有重要意義。在生物防治方面，嗜鐵素對多種病原菌具有抑制作用，為開發(fā)生物農(nóng)藥具有潛在價(jià)值。短短芽孢桿菌GZDF3分離自半夏根際土壤，對尖孢鐮刀菌等多種病原菌有拮抗作用。本課題組通過AntiSMASH對短短芽孢桿菌GZDF3全基因組序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GZDF3基因組中沒有Bacillibactin嗜鐵素合成基因簇，但存在一個(gè)與Petrobactin嗜鐵素相似性高達(dá)83%的合成基因簇。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Petrobactin嗜鐵素合成基因家族中asbE基因缺失，不能合成Petrobactin嗜鐵素，證實(shí)asbE基因是Petrobactin嗜鐵素合成途徑中的關(guān)鍵基因。目前， Petrobactin嗜鐵素合成基因簇中的asbB[12]、asbD[13]、asbF[14]基因已有相關(guān)的功能與結(jié)構(gòu)研究，而對asbE基因的報(bào)道很少，因此本研究對Gene5693(asbE)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析并構(gòu)建原核表達(dá)載體進(jìn)行重組表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其與AsbE蛋白序列一致性達(dá)到51.06%，可認(rèn)為其同源。利用ExpASy數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)ProtParam程序分析預(yù)測嗜鐵素合成基因的氨基酸序列和相關(guān)的理化性質(zhì)，初步判定Gene5693蛋白是親水性穩(wěn)定蛋白質(zhì)。2009年，余賢美等[19]在枯草芽孢桿菌 CAS15 嗜鐵素基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，用IPTG 在 30 ℃誘導(dǎo) 4 h 實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，并進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前，還未見短短芽孢桿菌中嗜鐵素合成基因的研究。

本研究采用PCR方法克隆了短短芽孢桿菌GZDF3嗜鐵素合成基因Gene5693，進(jìn)行生物信息學(xué)和理化性質(zhì)分析，短短芽孢桿菌GZDF3基因組中存在多種編碼次級代謝產(chǎn)物的基因簇，其中一種基因簇編碼產(chǎn)物為嗜鐵素，并且與Petrobactin嗜鐵素相似性達(dá)到83%，Gene5693與AsbE蛋白的氨基酸序列一致性達(dá)到51.06%，編碼的蛋白為酸性蛋白。進(jìn)一步構(gòu)建原核表達(dá)載體并成功分離純化獲得Gene5693蛋白。

綜上所述，本研究成功克隆了短短芽孢桿菌GZDF3嗜鐵素合成基因Gene5693并構(gòu)建重組表達(dá)載體，并成功誘導(dǎo)表達(dá)。這將為進(jìn)一步研究短短芽孢桿菌GZDF3中嗜鐵素合成基因簇的功能及體外合成研究奠定一定的理論基礎(chǔ)，從而為短短芽孢桿菌GZDF3在促進(jìn)植物生長和植物病害生物防治中的應(yīng)用提供參考。