韓春哲, 郭昱良, 陳 楊, 桂 馨

(同濟大學生命科學與技術學院, 上海200092)

納米材料用于殺菌是納米生物學研究的熱點, 其中石墨烯納米片在抑菌方面的研究備受關注[1-5]. 石墨烯是當前最薄的二維納米材料, 有巨大的比表面積. 與其他材料相比, 在質量相同的情況下, 石墨烯納米片有更多的表面與細菌接觸, 從而有可能更高效地殺傷細菌.

雖然石墨烯納米片的兩側及其邊界都能吸附藥物, 但這些敞開的表面對其所載藥物的緩釋作用不佳. 若將石墨烯構筑而成的碳納米籠(graphic carbon nanocages, GCNCs)作為抑菌材料, 則有可能保留石墨烯的優(yōu)勢, 又可以緩釋藥物, 達到多模式抑菌的效果.

GCNCs 是由石墨化碳殼層構筑而成的具有空心結構特點的納米粒子. 富勒烯是目前粒徑最小的GCNCs(直徑僅約0.71 nm), 但其內部空腔幾無載藥功能. 通過含碳原子的前驅體(如金屬碳基類化合物)以高溫碳化方式獲得的GCNCs, 不僅具有石墨殼層結構特點, 還有較大體積的內部空腔, 為后續(xù)載藥提供了方便. 石墨殼層結構的GCNCs 因具有特殊的光電子特性,在電子屏蔽材料、太陽能吸收劑、催化劑、傳感器、鋰電池碳極等領域有較廣泛的應用[6-11].目前, GCNCs 在生物醫(yī)學領域的應用主要涉及對生物分子的吸附研究[12-13].

本課題組發(fā)現, GCNCs 是一種性能優(yōu)異的光熱轉化材料, 這種熱效應可用于殺菌.GCNCs 自身的毒性很小, 只有在激光照射下才會對細菌進行熱殺傷, 因此其對環(huán)境產生污染的影響較小. 本工作結果將推動GCNCs 在生物醫(yī)學領域, 尤其是在殺菌領域的研究.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌(E.coli)菌種干粉購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心. 蛋白胨、酵母提取粉購自Oxide 公司. 瓊脂購自上海沃凱化學試劑有限公司. 碳基鐵、無水乙醇等其他試劑均購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 GCNCs 合成及形貌表征

參考文獻[14]合成GCNCs. 稱取0.15 g 羰基鐵溶于3 mL 無水乙醇, 置于真空管式爐中.在氮氣保護下, 以5?C/min 的升溫速率升高到800?C, 并在該溫度下反應30 min. 在氮氣保護下自然冷卻. 收集粉末, 將樣品置于50 mL 圓底燒瓶中, 加10%的鹽酸30 mL, 70?C 回流24 h. 高速離心, 棄上清, 沉淀加蒸餾水洗滌3 次后進行冷凍干燥, 得到GCNCs. 通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察GCNCs 的形貌.

1.2.2 671 nm 激光誘導GCNCs 的光熱轉換檢測

用去離子水分散GCNCs 粉末, 獲得濃度為0.05 和0.10 mg/mL 的兩種溶液. 每個樣品各取200 μL, 置于透明小玻璃管中, 開口處以封口膜封閉. 以低功率密度(0.2 W/cm2)的671 nm 激光照射樣品, 使用紅外熱像儀檢測樣品升溫速率. 以200 μL 去離子水在激光照射下的升溫速率作為對照. 每個樣品在每個照射時間節(jié)點進行3 次相同的照射實驗.

1.2.3 LB 培養(yǎng)基的配置

稱取NaCl 10 g、蛋白胨10 g、酵母提取粉5 g, 溶解于1 000 mL 蒸餾水中, 并在高壓滅菌鍋中121?C 加壓滅菌20 min, 之后于4?C 保存?zhèn)溆? 如需固體培養(yǎng)基, 則在上述配方中加20 g 瓊脂粉, 滅菌后趁熱倒入平板, 冷卻凝固后于4?C 保存?zhèn)溆?

1.2.4 大腸桿菌培養(yǎng)及活性菌液的制備

在37?C 預熱的35 mL 液體LB 培養(yǎng)基中加入少量大腸桿菌干粉粉末, 置于50 mL 離心管內, 于37?C, 220 r/min 搖床上培養(yǎng)過夜. 待菌液的OD600值約為0.5 時, 取0.1 mL 菌液重新加入35 mL 液體LB 培養(yǎng)基中, 同條件培養(yǎng)過夜. 之后用液體培養(yǎng)基將菌液的OD600值調整至0.5 后備用, 此時大腸桿菌的菌體濃度為5×108/mL.

1.2.5 GCNCs 對大腸桿菌生長過程中的毒性影響

取0.1 mL 上述菌液加入15 mL 培養(yǎng)基中, 并加入高壓滅菌后的GCNCs, 使其終濃度為1 mg/mL. 在前述條件下進行培養(yǎng), 并設置未加GCNCs 的菌液作為對照. 2 h 后, 每隔1 h 取0.1 mL 菌液檢測OD600值, 用于繪制生長曲線, 直至吸收值不再明顯增加. 實驗平行進行3 次.

1.2.6 激光誘導GCNCs 對大腸桿菌的殺傷作用實驗

取0.1 mL 上述菌液于2 mL 透光離心管中, 分別加入GCNCs 形成濃度梯度, 并分別用670 nm 近紅外激光在管壁處照射20 min. 取不加GCNCs 的菌液進行同樣的激光照射作為對照. 照射完畢后使用梯度稀釋(103, 104及105倍)涂板法對菌液內的活菌數目進行記數, 并以無GCNCs 菌液的活菌數目作為標準計算活菌抑制率. 每個實驗重復3 次.

取0.1 mL 上述菌液于2 mL 透光離心管中, 加入GCNCs 使其終濃度為Cmin, 并分別用670 nm 近紅外激光在管壁處照射不同時間,形成時間梯度.照射完畢后,使用梯度稀釋(103,104及105倍)涂板法對菌液內的活菌數目進行記數, 并以未進行激光照射的菌液的活菌數目作為標準計算活菌抑制率. 每個實驗重復3 次.

1.2.7 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 22 提供的單因素ANOVA 分析樣本各組間差異性, 其中*p ＜0.05 為具有統(tǒng)計學差異, **p ＜0.01 為具有顯著的統(tǒng)計學差異, ***p ＜0.001 為具有極顯著的統(tǒng)計學差異.

2 實驗結果與討論

2.1 GCNCs 在671 nm 激光照射下的光熱轉換

本工作以羰基鐵為主要原料合成的GCNCs 樣品如圖1 所示. 這些粒子大部分為空心結構, 單個粒子直徑主要分布在20～50 nm.

圖1 GCNCs 的TEM 照片Fig.1 TEM image of GCNCs

紅外熱像儀檢測結果顯示, GCNCs 水溶液在671 nm 激光照射下, 升溫迅速. 由圖2 可見: 當GCNCs 濃度僅為0.05 mg/mL 時, 激光照射1 min 即可使200 μL 的溶液從最初的22.1±0.2?C 上升到30.5±0.9?C; 照射20 min 時, 溶液溫度可達45.7±1.0?C, 平均升溫幅度超過22?C. 隨著GCNCs 濃度增加, 升溫幅度更加顯著. 當GCNCs 濃度提高到0.1 mg/mL,激光照射20 min 時, 溶液溫度從最初的22.1±0.2?C 上升到50.8±0.4?C; 而相同體積的去離子水在激光照射20 min 后, 僅從最初的溫度上升到27.7±0.5?C. 可見, GCNCs 是一種性能優(yōu)異的光熱轉化材料.

2.2 GCNCs 對大腸桿菌生長的影響

GCNCs 本身對細菌毒性小. 如圖3 所示, 當向大腸桿菌中加入高壓滅菌后的GCNCs 并使菌液中的GCNCs 濃度高達1 mg/mL 時, 無論是對數生長期(約6～8 h), 還是穩(wěn)定生長期(約12 h 后), 大腸桿菌的生長速度都與未加GCNCs 的生長速度無明顯差別, 生長曲線幾乎重合.這表明GCNCs 可能是一種環(huán)境友好型的納米材料.

圖2 去離子水分散的GCNCs 及單純的去離子水在671 nm 激光照射下的升溫Fig.2 Temperature increase of distilled water containing GCNCs and distilled water alone upon 671 nm laser irradiation

圖3 1 mg/mL GCNCs 對大腸桿菌生長的影響Fig.3 Effect of 1 mg/mL GCNCs on the growth of E. coli

2.3 671 nm 激光照射下GCNCs 對大腸桿菌的殺傷作用

GCNCs 在671 nm 激光照射下,能高效殺傷細菌. 如圖4 所示: 當大腸桿菌中的GCNCs 濃度僅為1 μg/mL 時, 在671 nm 激光照射20 min 后, 細菌生長受到顯著抑制; 隨著GCNCs 濃度的升高, 抑制效果更顯著, 當濃度達到75 μg/mL 時, 視野中僅存極少活菌; 當濃度達到100 μg/mL 或更高時, 細菌全部被殺滅; 而單純的671 nm 激光照射對大腸桿菌的生長無明顯影響. 可見, GCNCs 在671 nm 激光照射下產生的熱效應是殺滅細菌的良好手段.

定量檢測可進一步證實GCNCs 的光熱效應能高效殺菌. 如圖5 所示, 當GCNCs 濃度極低, 僅為5 μg/mL 時, 激光照射后細菌數量與對照組(不含GCNCs)相比減少了30%, 活菌數存在顯著的統(tǒng)計學差異(p ＜0.01); 當濃度提高2 倍(即10 μg/mL)后, 活菌數與對照組相比有極顯著的統(tǒng)計學差異(p ＜0.001); 當濃度為100 μg/mL 時, 活菌數為0.

圖4 不同濃度GCNCs 經20 min 671 nm 激光照射后的抑菌效果(定性檢測結果)Fig.4 Antibacterial effects of GCNCs on E. coli with different concentrations under 671 nm laser irradiation for 20 min (qualitative test results)

圖5 不同濃度GCNCs 經20 min 671 nm 激光照射后的抑菌效率(定量檢測結果)Fig.5 Antibacterial efficiency of GCNCs on E. coli with different concentrations under 671 nm laser irradiation for 20 min (quantitative test results)

在此基礎上, 將大腸桿菌中的GCNCs 濃度穩(wěn)定在100 μg/mL, 考察671 nm 激光照射時間對殺菌效果的影響, 結果如圖6 和7 所示. 可見, 激光照射僅1 min 時, 活菌數就開始減少; 照射5 min 時, 82%的細菌被殺滅; 照射15 min 時, 計數平板上已無菌落, 表明細菌被全部殺滅.如果提高GCNCs 濃度, 則可以在更短的時間內殺滅細菌.

可見, GCNCs 在671 nm 激光照射下殺菌具有如下優(yōu)點: GCNCs 生物相容性好, 使用濃度低, 殺菌時間短而高效.

圖6 100 μg/mL 的GCNCs 經不同時間671 nm 激光照射后的抑菌效果(定性檢測結果)Fig.6 Antibacterial effects of 100 μg/mL GCNCs on E. coli under 671 nm laser irradiation for different time period (qualitative test results)

圖7 100 μg/mL 的GCNCs 經不同時間671 nm 激光照射后的抑菌效率(定量分析結果)Fig.7 Antibacterial efficiency of 100 μg/mL GCNCs on E. coli under 671 nm laser irradiation for different time period (quantitative test results)

3 結束語

以羰基鐵為主要前驅體合成了GCNCs. 該GCNCs 在671 nm 激光照射下能迅速將激光能量轉化為熱能, 其光熱效應對大腸桿菌有很好的殺傷效果, 且在很低濃度和激光照射時間很短的情況下即可完全殺滅細菌. 由于GCNCs 有容積可觀的內部空腔, 這為今后裝載抗生素或其他殺菌藥物, 進而進行多模式殺菌提供了條件. 本工作合成的GCNCs 及其用于殺菌的方法為抗菌領域引入了新的材料, 對于推動GCNCs 的生物醫(yī)學應用和改進殺菌策略有重要意義.

致謝感謝同濟大學生命科學與技術學院的儲茂泉教授提供研究思路和實驗條件, 并參與有意義的討論.