苑 婕, 馬方瑋, 李夢(mèng)云, 曹 慶, 鄭偉尉, 萬嗣寶

(1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院上海市能源作物育種及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海200444;2. 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州311300)

泛素/26S 蛋白酶體系統(tǒng)在真核生物中能夠修飾蛋白, 從而使蛋白質(zhì)有選擇性地降解[1-2].作為一種強(qiáng)有力的監(jiān)管調(diào)控機(jī)制, 泛素/26S 蛋白酶體系統(tǒng)參與細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)與凋亡、生物與非生物脅迫等幾乎每一個(gè)重要的生命過程[3-5]. 有研究指出, 擬南芥中泛素/26S 蛋白酶體系統(tǒng)涉及到的蛋白超過擬南芥總蛋白的6%[6]. 泛素化是該系統(tǒng)發(fā)揮作用所必需的. 這個(gè)過程需要3 種酶, 分別是泛素激活酶(ubqiuitin-activating enzyme, 簡(jiǎn)稱El)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, 簡(jiǎn)稱E2)、泛素連接酶(ubiquitin ligase, 簡(jiǎn)稱E3)[7].泛素首先被E1 催化, 形成高能硫酯鍵; 然后被激活的泛素轉(zhuǎn)移到E2 上; 最后通過E3, 在泛素的末端和靶蛋白的賴氨酸殘基上形成異肽鍵[8]. 通過這3 種酶, 將單一或多個(gè)泛素偶聯(lián)到靶蛋白上, 由26S 蛋白酶體復(fù)合物將被識(shí)別的靶蛋白降解[9].

E3 泛素連接酶是泛素/26S 蛋白酶體系統(tǒng)中最重要的一類酶, 雖然發(fā)現(xiàn)最晚, 但種類多樣且功能最為復(fù)雜[10-11], 其中識(shí)別被泛素化的靶蛋白是其最主要的功能. 由于底物的特異性由E3 決定, 所以E3 在整個(gè)蛋白質(zhì)的降解過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12-13]. 研究表明, E3 泛素連接酶在動(dòng)植物中可調(diào)控多個(gè)生理代謝途徑. Silvia等[14]研究發(fā)現(xiàn), E3 泛素連接酶PJA1 基因通過對(duì)EZH2 蛋白的降解促進(jìn)細(xì)胞分化, 從而促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的生成. Liu等[15]發(fā)現(xiàn), E3 泛素連接酶smurf1 與smurf2 基因能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化, 有利于骨折愈合. Wei等[16]研究表明, E3 泛素連接酶YopM 通過作用于NLRP3 蛋白而使病變細(xì)胞死亡.Dong等[17]研究表明, E3 泛素連接酶PRT1 基因通過作用于泛素化的DA1 蛋白酶而限制了細(xì)胞的無限增殖. E3 泛素連接酶在植物響應(yīng)脅迫信號(hào)的應(yīng)答過程中也發(fā)揮了重要作用. 干旱脅迫處理轉(zhuǎn)紫萼蘚DSR7 基因的擬南芥植株, 發(fā)現(xiàn)植株的含水率及成活率均高于野生型, 說明該基因能增強(qiáng)植物的抗干旱能力[18]. 在擬南芥中轉(zhuǎn)入棉花SARP1 基因, 在鹽脅迫條件下, 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽率低于野生型, 說明該基因負(fù)調(diào)控植物耐鹽性[19]. 在冷害脅迫下, 水稻中的E3 泛素連接酶HOS1 基因的表達(dá)量增加[20-21], 說明該基因能提高植物的抗寒性.

本研究以“久?！彼厶覟閷?shí)驗(yàn)材料, 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)克隆出水蜜桃E3 泛素連接酶PpARI1 基因序列, 并進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 同時(shí)成功構(gòu)建了表達(dá)載體pCAMBIAy1300-PpARI1, 為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和該基因的功能分析奠定了基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以上海市浦東新區(qū)生產(chǎn)的“久?！彼厶?Prunuspersica L. cv. Jiubao)果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料,取樣后立即送回實(shí)驗(yàn)室處理.

1.2 菌株、載體和試劑

pGM-T 載體、DNA Marker Ⅲ、大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞、6×DNA Loading Buffer、質(zhì)粒小提試劑盒、T4 DNA 連接酶, 購自北京天根生化科技有限公司. 表達(dá)載體pCAMBIAy 1300 和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞, 由本實(shí)驗(yàn)室提供. Reverse Transcription System(Cat.#A3500)試劑盒, 購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司. 柱式植物RNAout 2.0 試劑盒、即用型高保真PCR 試劑盒, 購自北京天恩澤基因科技有限公司. Taq DNA 聚合酶, 限制性核酸內(nèi)切酶Xba Ⅰ與BamH Ⅰ, 購自寶生物工程(大連)有限公司. 柱式DNA 膠回收試劑盒、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、慶大霉素(Gen), 購自生工生物工程(上海)股份有限公司, 引物也由該公司合成. 其他常規(guī)生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PpARI1 基因的克隆

2.1.1 水蜜桃果實(shí)總RNA 的提取與PpARI1 基因的擴(kuò)增

按照柱式植物RNAout 2.0 試劑盒說明書的操作步驟提取水蜜桃果實(shí)的總RNA. 參照Reverse Transcription System(Cat.#A3500)試劑盒說明書的操作步驟合成cDNA. 以大豆ARI1 核酸序列(NM 001289243)為探針,在NCBI 網(wǎng)站對(duì)桃的核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線BLAST,搜索到與之同源性為80%的一條具有完整開放閱讀框(open reading frame, ORF)的核苷酸序列(XM 007221935). 根據(jù)此序列, 用Primier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物, 上游引物為5’-ATGGACTCCGAGGACGATA-3’,下游引物為5’-TCACCGTCGCTGGTGGTGGCACATG-3’. 以水蜜桃果實(shí)cDNA 為模板, 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增. 反應(yīng)體系如下: 高保真PCR Mix 15 μL,cDNA 2 μL, 上下游引物各1 μL, 加雙蒸水至30 μL. 反應(yīng)程序如下: 94?C 預(yù)變性5 min;94?C 變性30 s, 50?C 退火40 s, 72?C 延伸2 min, 35 個(gè)循環(huán); 72?C 再延伸10 min, 4?C 終止反應(yīng). 取PCR 產(chǎn)物44 μL, 加入4 μL dNTP 和2 μL Taq DNA 聚合酶, 72?C 孵育45 min, 進(jìn)行加A 處理.

2.1.2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化及測(cè)序

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切下目的條帶, 用膠回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化回收, 將回收產(chǎn)物與pGM-T 載體連接. 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞, 在含Amp(50 μg/mL)和X-Gal, IPTG 的LB 瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選. 培養(yǎng)12 h 后挑選白色單菌落搖菌. 經(jīng)PCR 驗(yàn)證后, 選取陽性結(jié)果菌液保存, 并送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序.

2.1.3 PpARI1 基因的序列分析

在GDR 網(wǎng)站(http://www.rosaceae.org/gb/gbrowse/prunus_ persica/)對(duì)PpARI1 基因進(jìn)行染色體定位分析. 進(jìn)入GSDS 網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php), 在CDS Sequences 欄輸入鑒定出的PpARI1 基因的編碼區(qū)序列, 在Genomic sequences 欄輸入該基因全長(zhǎng)序列, 點(diǎn)擊左下方處Submit 按鈕, 分析PpARI1 序列的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu). 用EXPASy 網(wǎng)站的ProtParam 在線程序(http://web.expasy.org/protparam/)分析PpARI1 蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)以及疏水性情況.

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2.1 以兩端添加Xba Ⅰ與BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的新引物克隆PpARI1 基因

以測(cè)序正確的菌液為材料, 重新設(shè)計(jì)兩端添加Xba Ⅰ與BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增. 上游引物為5’-GCTCTAGAATGGACTCCGAGGACGATA-3’; 下游引物為5’-CGGGATCC TCACCGTCGCTGGTGGTGGCACATG-3’. 反應(yīng)體系與程序同2.1.1 節(jié), 回收PCR 產(chǎn)物與pGM-T 載體連接之后, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行測(cè)序.

2.2.2 構(gòu)建植物高效表達(dá)載體

取測(cè)序成功后的菌液,用試劑盒提取質(zhì)粒. 使用Xba Ⅰ與BamH Ⅰ對(duì)pGM-T-PpARI1 重組質(zhì)粒和真核表達(dá)載體pCAMBIAy1300 進(jìn)行雙酶切. 回收目的基因片段和真核表達(dá)載體片段之后, 用T4 DNA 連接酶16?C 連接過夜. 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含Kan(50 μg/mL)的LB 平板上. 培養(yǎng)12 h 后挑選白色單菌落, 搖菌并提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR 檢測(cè)和酶切驗(yàn)證正確后測(cè)序.

2.2.3 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

取含有重組表達(dá)載體的質(zhì)粒5 μL, 加入到處于冰水混合狀態(tài)的農(nóng)桿菌中, 用熱激法轉(zhuǎn)化后加入800 μL LB 液體培養(yǎng)基, 于28?C 振蕩培養(yǎng)3～4 h. 8 000 r/min 離心后, 留取少量上清液輕輕吹打. 重懸菌塊涂布于含50 μg/mL Kan, 50 μg/mL Rif 和50 μg/mL Gen 的YEP 培養(yǎng)基上, 于28?C 倒置培養(yǎng)2 d. 待平板上長(zhǎng)出白色單菌落后, 挑菌培養(yǎng), 提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證.

3 結(jié)果與分析

3.1 PpARI1 基因的PCR 擴(kuò)增

以水蜜桃總RNA 反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 為模板, 利用桃ARI1 基因特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增.經(jīng)1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在1 800 bp 左右,與預(yù)期的目的基因大小一致,如圖1 所示, 其中M 為DNA Marker Ⅲ, 1～3 為擴(kuò)增產(chǎn)物. 將該片段回收, 與pGM-T 載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞, 篩選陽性克隆, 進(jìn)行測(cè)序, 得到一條長(zhǎng)度為1 764 bp 的基因序列, 命名為PpARI1. 該序列已提交到GenBank, 登錄號(hào)為KY887584.

圖1 目的基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of the target gene

3.2 PpARI1 基因的序列分析

3.2.1 比對(duì)結(jié)果用DNAMAN 軟件將測(cè)序結(jié)果序列與預(yù)測(cè)序列進(jìn)行比對(duì), 其核苷酸序列的一致性高達(dá)99.83%. 氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果顯示, 二者只存在一個(gè)氨基酸的差異, 結(jié)果如圖2 所示.

3.2.2 PpARI1 的定位及結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)PpARI1 編碼區(qū)序列, 在GDR 網(wǎng)站中找到了PpARI1 基因的染色體結(jié)合位點(diǎn). 位點(diǎn)位于scaffol上, PpARI1 基因的堿基序列從16 694 469～16 704 710 bp.

根據(jù)PpARI1 基因序列, 在GSDS 網(wǎng)站中檢索得到該序列的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(見圖3).分析序列結(jié)果表明, PpARI1 基因具有15 個(gè)外顯子和14 個(gè)內(nèi)含子.

3.2.3 PpARI1 編碼的氨基酸序列分析

使用ExPAsy 網(wǎng)站的在線程序Prot-Param Tool, 分析預(yù)測(cè)PpARI1 基因編碼的蛋白.結(jié)果如下: 該蛋白的等電點(diǎn)pI 為5.40, 屬于酸性蛋白; 分子量為66 726.45 Da, 蛋白的原子組成為C2883H4408N816O920S47; 帶正電的氨基酸(Lys+Arg)數(shù)量為69, 帶負(fù)電的氨基酸(Glu+Asp)數(shù)量為90, 不穩(wěn)定系數(shù)為50.08, 推測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定; 總平均疏水指數(shù)為-0.682. 由此可見, PpARI1 蛋白為親水性蛋白.

圖2 PpARI1 氨基酸序列與預(yù)測(cè)桃ARI1 氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果Fig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences between PpARI1 and the predicted ARI1

圖3 PpARI1 基因的結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Structural analysis of PpARI1 gene

3.3 PpARI1 基因正義表達(dá)載體的構(gòu)建

將用新引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物與pGM-T 連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞, 測(cè)序正確后提取質(zhì)粒, 用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切pGM-T-PpARI1 質(zhì)粒, 回收目的基因序列, 如圖4(a)所示.

用相同的內(nèi)切酶對(duì)pCAMBIAy1300 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切, 回收大片段, 并與目的基因序列相連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞. 挑選單克隆用特異性引物進(jìn)行PCR 鑒定, 鑒定正確的進(jìn)行搖菌, 提取質(zhì)粒, 并用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切, 得到約1 800 bp 的小片段, 如圖4(b)所示. 測(cè)序結(jié)果完全正確, 說明表達(dá)載體pCAMBIAy1300-PpARI1 構(gòu)建成功.

3.4 PpARI1 基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

采用熱激法將pCAMBIAy1300-PpARI1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞, 挑取單克隆搖菌并提取質(zhì)粒. 以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 鑒定, 得到的條帶大小與目的基因大小一致, 如圖5 所示. 這表明PpARI1 基因的正義表達(dá)載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中.

圖4 重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Double enzyme digestion of the recombinant plasmids

圖5 pCAMBIAy1300-PpARI1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR 驗(yàn)證Fig.5 Verification of the recombinant plasmid pCAMBIAy1300-PpARI1 in Agrobacterium by PCR

4 討 論

水蜜桃果實(shí)多汁, 具有潤(rùn)肺、祛痰、清胃等功效, 其蛋白質(zhì)、鐵元素含量高且富含多種維生素, 深受廣大消費(fèi)者喜愛. 然而, 水蜜桃果樹開花期易受干旱脅迫, 造成嚴(yán)重減產(chǎn); 果實(shí)在低溫運(yùn)輸、貯藏過程中也易發(fā)生冷害, 影響貨架期. 在植物的發(fā)育過程中, E3 泛素連接酶參與了從胚胎發(fā)育到花器官產(chǎn)生幾乎所有的發(fā)育過程, 控制著植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等過程中的關(guān)鍵步驟[22].

RING 蛋白家族是E3 泛素連接酶的一類. 在環(huán)境脅迫條件下, 很多RING 結(jié)構(gòu)域基因被誘導(dǎo)表達(dá), 增強(qiáng)了植物對(duì)逆境的抵抗能力. Qin等[23]從擬南芥中鑒定出ATRF1 基因. 該基因編碼的氨基酸含有RING 典型結(jié)構(gòu)域C3HC4, 能被鋁離子誘導(dǎo)表達(dá). 將該基因在植物體內(nèi)過量表達(dá), 發(fā)現(xiàn)能明顯增強(qiáng)植物的抗鋁毒能力. Qi等[24]從番茄中分離出RING 基因. 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其在野生番茄的所有組織中都能表達(dá). 將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥后, 能增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性. 另有研究表明, 水稻中的CTR1 基因編碼一個(gè)具有E3 泛素連接酶活性的RING 蛋白. 將植株進(jìn)行干旱脅迫處理后發(fā)現(xiàn), RING 蛋白的基因表達(dá)量明顯升高, 再將其轉(zhuǎn)入擬南芥后, 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗干旱能力增強(qiáng)[25].

ARI1 基因?qū)儆赗ING 結(jié)構(gòu)域家族, 除了在大豆中發(fā)現(xiàn)其具有耐鋁毒性外, 其生理功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證. 驗(yàn)證基因功能最有效的方法就是轉(zhuǎn)基因技術(shù). 本實(shí)驗(yàn)采用柱式植物RNAout2.0 試劑盒法提取了水蜜桃果實(shí)總RNA, 有效避免了基因組DNA 的污染問題, 無多糖、蛋白等雜質(zhì), 純度較高. 由于擴(kuò)增的目的基因較長(zhǎng), 為保證高準(zhǔn)確率, 使用了高保真Pfu DNA 聚合酶. 為使PpARI1 基因能與pCAMBIAy1300 相連, 需要在PpARI1 基因兩端添加酶切位點(diǎn). 由于pCAMBIAy1300 本身含有Kpn Ⅰ, Sac Ⅰ, Xba Ⅰ與BamH Ⅰ4 個(gè)酶切位點(diǎn), 對(duì)PpARI1 基因進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析, 發(fā)現(xiàn)序列本身含有Kpn Ⅰ, 而pGM-T 載體中又含有Sac Ⅰ, 故選擇Xba Ⅰ與BamH Ⅰ. 在pCAMBIAy1300 表達(dá)載體中, 這兩個(gè)酶切位點(diǎn)距離最近, 因此在雙酶切定向連接時(shí)難度較大, 需要反復(fù)實(shí)驗(yàn), 確認(rèn)體系中質(zhì)粒與目的基因的濃度比例.

本研究最終得到了轉(zhuǎn)基因工程菌, 為進(jìn)一步研究PpARI1 基因的分子生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ), 進(jìn)而為選育抗逆水蜜桃品種提供了理論依據(jù).