吳興達(dá) 曾 琳 呂群松*

（1 廣東醫(yī)科大學(xué)信息工程學(xué)院，廣東 東莞 523808；2 廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 東莞 523808）

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈血管支架植入是目前治療冠心病的一種重要手段，臨床上廣泛使用的藥物洗脫支架會(huì)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞層修復(fù)延遲，容易發(fā)生支架植入后再狹窄的風(fēng)險(xiǎn)[1]。支架表面的快速內(nèi)皮化可減少血小板的激活及血栓形成，形成生物相容性良好的界面，降低遠(yuǎn)期血栓的風(fēng)險(xiǎn)。本文比較HUVECs在三種不同鈦表面的活性和增殖行為，探討促進(jìn)支架材料表面快速內(nèi)皮化的方法。

1 材料與方法

1.1 載槲皮素殼聚糖納米粒的制備：采用離子交聯(lián)法，首先配置2 mg/mL的殼聚糖醋酸溶液，磁力攪拌下逐滴滴入槲皮素的乙醇溶液，使槲皮素與殼聚糖的質(zhì)量比為1∶20，再逐滴滴入三聚磷酸鈉溶液，連續(xù)攪拌得到淡黃色的膠體溶液。使用Microtrac粒度分析儀分析納米粒大小及Zeta電位。

1.2 三種鈦表面的制備及表征：依次用800、1200、1500、2000目砂紙及拋光布將商業(yè)鈦片拋光至鏡面狀態(tài)，再分別用丙酮、無水乙醇和蒸餾水超聲清洗，獲得光滑表面鈦片。將光滑鈦片在80 ℃的5 mol/L NaOH溶液中浸泡24 h，再置于80 ℃的蒸餾水中浸泡12 h，最后蒸餾水超聲清洗，獲堿熱處理鈦片。堿熱處理鈦片浸泡在載槲皮素殼聚糖膠體中，10 h后取出，用蒸餾水漂洗去表層未吸附的納米粒，獲得生物化修飾鈦片。三種鈦片干燥噴金后用掃描電子顯微鏡觀察表面形貌。

1.3 HUVECs的培養(yǎng)：HUVECs（購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫）培養(yǎng)于含5%胎牛血清，1%內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（ECGS）和1%青霉素/鏈霉素的ECM培養(yǎng)液中。采用培養(yǎng)瓶常規(guī)培養(yǎng)，以0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.4 HUVECs活性及增殖能力檢測：三種鈦片置于12孔板內(nèi)，HUVECs按2×104cells/孔接種于鈦片上，分別孵育24 h和48 h。吸取培養(yǎng)液，加入Calcein-AM （Invitrogen）和碘化丙啶（PI, Sigma-Aldrich）混合液1 mL/孔浸泡樣品，37 ℃避光孵育20 min后，用PBS洗去多余染料。4%多聚甲醛固定，熒光顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié) 果

2.1 載槲皮素殼聚糖溶液的檢測：紅色激光筆照射載槲皮素殼聚糖溶液可見明顯的丁達(dá)爾效應(yīng)，粒徑分析表明絕大部分納米粒粒徑介于100～300 nm，Zeta電位為50.4 mV。見圖1。圖1顯示，紅色光束穿過殼聚糖溶液，未見丁達(dá)爾效應(yīng)，表明殼聚糖的醋酸溶液是真溶液；紅色光束穿過槲皮素/殼聚糖溶液，側(cè)面可見溶液內(nèi)部可見光束“通路”，丁達(dá)爾效應(yīng)顯著，表明該溶液是膠體；槲皮素難溶于水，經(jīng)攪拌，其在水中形成渾濁液，光束無法穿透。

2.2 掃描電鏡觀察鈦片結(jié)果：拋光后的鈦片表面平整，堿熱處理后的鈦片表面均勻分布大量亞微米量級大小的孔洞，吸附載槲皮素殼聚糖納米粒后孔洞結(jié)構(gòu)被覆蓋，顯得相對平滑。見圖2、3。

2.3 細(xì)胞活性和增殖情況：熒光顯微鏡觀察表明三種鈦片表面均未見紅色的死亡細(xì)胞，所有細(xì)胞均呈綠色，表明三種鈦片都具有良好的細(xì)胞相容性。細(xì)胞增殖方面，孵育24 h后，光滑鈦片表面細(xì)胞較少，堿熱處理鈦片表面細(xì)胞稍多，而生物化修飾鈦片的細(xì)胞明顯多于光滑鈦片細(xì)胞；孵育48 h后，三種鈦片表面細(xì)胞密度差異明顯增大，尤其是生物化修飾鈦片表面的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于光滑表面的細(xì)胞（圖4）。

3 討 論

鈦及其合金密度小、機(jī)械性能好、化學(xué)性能穩(wěn)定，是一種廣泛使用的生物材料，然而并不適用于與血液直接接觸的應(yīng)用場景[2]。在人工血管、血管支架等血液接觸材料的設(shè)計(jì)中，抗凝血和內(nèi)皮化是必須解決的兩大問題，其中實(shí)現(xiàn)材料表面的快速內(nèi)皮化可降低血栓發(fā)生率。殼聚糖是天然多糖甲殼素脫乙酰化而得到的一種堿性氨基多糖，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)中的糖胺多糖相似，因此具有極為優(yōu)良的生物相容性和生物學(xué)活性，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3]。槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，廣泛存在于植物中，是多種中藥的主要成分，能抑制過氧化氫（金屬表面在體液內(nèi)被腐蝕的產(chǎn)物）對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[4]。

圖1 激光筆照射三種液體的檢測結(jié)果

圖2 槲皮素-殼聚糖納米粒的粒徑分布

圖3 掃描電鏡觀察鈦片結(jié)果

圖4 細(xì)胞在三種鈦片表面分別孵育結(jié)果

本文通過堿熱處理在鈦表面腐蝕出大量均勻分布的亞微米級孔洞，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明粗糙表面比光滑表面更有利于內(nèi)皮細(xì)胞增殖，這與成骨細(xì)胞的情況類似[5]。同時(shí)堿熱處理增加了鈦表面的羥基數(shù)量，使表面帶負(fù)電荷，這是靜電吸附載槲皮素殼聚糖納米粒的基礎(chǔ)。而大量亞微米級孔洞也增大了鈦材吸附殼聚糖納米粒的面積，因而增加了載藥量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表面粗糙結(jié)構(gòu)及生物化修飾均有利于內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而二者相結(jié)合，可極大地促進(jìn)材料表面的快速內(nèi)皮化。因此本研究為降低支架內(nèi)再狹窄率，優(yōu)化血管支架的遠(yuǎn)期療效提供了方法上的參考。