朱華玉 宋芃垚 郭祿芹 李嚴曼 孫守如 楊路明

目的與意義： 隨著新一代全基因組測序技術的快速發(fā)展，越來越多的物種開發(fā)了大量的覆蓋全基因組的SSR標記。雖然在西瓜上也開發(fā)了一些SSR標記，并已經(jīng)在連鎖圖譜和遺傳多樣性研究中得到應用，但仍存在多態(tài)性低、基因組覆蓋率低等問題。本研究從西瓜全基因組水平分析了不同類型SSR序列的分布及頻率。并開發(fā)了覆蓋全基因組的SSR標記，同時通過電子 PCR的方法確定了在甜瓜、黃瓜中通用的SSR分子標記，并利用這些通用SSR標記進一步明確了西瓜與黃瓜以及甜瓜3個物種之間的染色體共線性關系。本研究同時篩選了32對高多態(tài)性SSR標記對134份西瓜材料進行了遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析。

材料與方法： 利用西瓜全基因組序列（http：//www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi），用MISA（Microsatellite identification tool） 軟件識別SSR序列。用Primer3 （v. 1.1.4）進行SSR引物設計。將西瓜全基因組SSR標記通過perl語言編寫的腳本，利用BLAST分別在黃瓜和甜瓜基因組中進行電子PCR分析。西瓜、甜瓜、黃瓜之間染色體的共線性用 Circos software v 0.55 （http：//circos.ca）分析。并利用熒光原位雜交（FISH）驗證染色體之間的共線性。選取134份西瓜材料提取基因組DNA，利用西瓜SSR標記和GeneAlEx 6.5、MEGA5、STRUCTURE2.3軟件進行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。

結(jié)果與分析： （1）對東亞栽培型西瓜‘97103的353.5 Mb序列分析，共得到39 523個SSR位點。所有SSR的總長度占西瓜基因組草圖全長的0.28%，平均為111個/Mb 。在不同個數(shù)的核苷酸重復類型中，SSR出現(xiàn)的頻率與核苷酸基數(shù)呈負相關。SSR出現(xiàn)的頻率隨著重復單元數(shù)量的增加而減少，與SSR重復單元的長度之間的關系尤為明顯。統(tǒng)計了每種SSR序列的核苷酸組成，發(fā)現(xiàn)AT、AAT、AAAT、AAAAT、AAAAAT、AAAAAAT和AAAAAAAT是每個重復類型中最豐富的重復基序。研究了每條西瓜染色體上SSR類型的頻率和分布，發(fā)現(xiàn)SSR位點的頻率與染色體大小無關。（2）為了確定西瓜SSR標記在葫蘆科不同物種間的應用，利用黃瓜和甜瓜的基因組序列作為模板，用西瓜全基因組SSR標記進行電子 PCR分析。在西瓜和黃瓜間通用的標記共891個，覆蓋黃瓜基因組190.42 Mb，占黃瓜基因組全長的98.87%，平均每條黃瓜染色體上有119個標記。西瓜和甜瓜中的通用標記共969個，覆蓋甜瓜基因組的310.94 Mb，占甜瓜基因組全長的98.29%，平均每條甜瓜染色體上有72個標記。在黃瓜、甜瓜、西瓜3個物種中都通用的SSR標記有448個，其在西瓜染色體上的分布見圖3。對西瓜的448個SSR標記進行電子PCR分析，將其產(chǎn)物利用EST、unigenes和CDS數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，其中在EST數(shù)據(jù)庫中可以檢測到21個SSR標記，19個SSR標記在unigene數(shù)據(jù)庫中表達，其中210個位于編碼區(qū)表明這些SSR標記與基因功能相關。（3）根據(jù)通用標記在黃瓜和西瓜對應的染色體上的位置，對兩個物種染色體之間的共線性關系進行推斷。西瓜和黃瓜之間的染色體共線性關系相對復雜，詳見表3。根據(jù)通用SSR標記在兩個物種基因組上的位置，可以將西瓜的染色體分為不同的區(qū)段，平均每個區(qū)段至少有3個SSR標記。在明顯區(qū)分的84個區(qū)段內(nèi)，有44個與黃瓜的染色體有較好的共線性，其余的40個在兩者之間有倒位現(xiàn)象。將西瓜與甜瓜之間做了類似的比較，在925個通用的SSR標記中有850個可用于兩者染色體共線性的分析。盡管西瓜和甜瓜具有相似的染色體數(shù)目，但他們?nèi)旧w之間的線性關系非常復雜。為了更直觀地了解葫蘆科植物的染色體之間的進化關系，以西瓜染色體為背景，對黃瓜和甜瓜的染色體進行重組作圖。該圖很好地解析了葫蘆科3個物種之間的染色體共線性關系。進一步利用原位雜交（FISH）的方法對基于SSR標記的染色體線性關系進行了驗證。熒光原位雜交的結(jié)果與利用SSR標記的比較作圖結(jié)果完全一致。（4）選擇分布于西瓜11條染色體上的32對多態(tài)性好的SSR標記進行西瓜遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示32個SSR標記在134份材料中的多態(tài)性表現(xiàn)良好。遺傳多樣性分析和群體結(jié)構(gòu)分析都將134份種質(zhì)分為2個類群，結(jié)果幾乎完全一致。從同一大陸收集的種質(zhì)并不完全聚為一類，表明西瓜已經(jīng)發(fā)生了不同的程度遷移和大陸之間的相互交流。

結(jié)? ? 論：本研究基于西瓜全基因組序列對各種SSR重復基序的頻率和分布等特征進行了統(tǒng)計分析，并開發(fā)了覆蓋西瓜全基因組的SSR標記。通過電子PCR的方法，對在西瓜、黃瓜、甜瓜3個物種間通用性SSR標記進行了篩選，這些標記為更準確地揭示三者基因組之間的共線性關系提供了充足的標記來源。此外，利用32對高多態(tài)性引物對134份材料進行聚類和群體結(jié)構(gòu)分析，兩種分析結(jié)果高度一致。本研究開發(fā)了大量的SSR分子標記和跨種間通用SSR標記，這些標記將會在圖譜構(gòu)建、基因定位、比較作圖和分子標記輔助育種等研究領域得到大量應用，同時也可為葫蘆科其他未完成測序物種提供重要的標記資源。