任美英，王翠峰，文榮，景學(xué)芬，付玉華

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

胸腔積液是肺部等多種疾病的常見并發(fā)癥，臨床上40%胸腔積液由惡性腫瘤引起。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）致惡性胸腔積液的病理診斷及其分型診斷難以明確，而胸腔積液細(xì)胞病理學(xué)檢查是目前具有診斷意義的檢查手段之一。

液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（thinprep cytogy test,TCT）是近些年應(yīng)用于細(xì)胞病理學(xué)診斷的一項(xiàng)新技術(shù)，TCT在宮頸和胸腔積液的細(xì)胞病理學(xué)檢查中有非常大的診斷價值[1-2]。而免疫組織化學(xué)法對于腫瘤細(xì)胞的分型診斷具有重要意義，但兩者聯(lián)合應(yīng)用于胸腔積液細(xì)胞病理學(xué)診斷及分型診斷的研究報道甚少。本研究擬探討TCT 聯(lián)合免疫組織化學(xué)進(jìn)行良惡性胸腔積液的鑒別診斷及由NSCLC 致惡性胸腔積液分型診斷的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月—2017年3月于內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)胞室收集的呼吸內(nèi)科、腫瘤內(nèi)科、腫瘤外科及胸外科等科室和外院送檢的脫落細(xì)胞學(xué)胸腔積液標(biāo)本703 例。應(yīng)用TCT 初檢，從診斷結(jié)果為可疑腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的標(biāo)本中選取281 例?；颊咦詈蠼?jīng)CT、磁共振及組織病理學(xué)確診為NSCLC 致惡性胸腔積液標(biāo)本137 例。其中，男性88 例，女性49 例；年齡30 ～85 歲；肺腺癌110 例、肺鱗癌25 例、肺腺鱗癌2 例。

1.2 主要試劑

TCT 試劑（湖北德立森科技有限公司），甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（thyroid transcription factor-1,TTF-1）、細(xì)胞角蛋白5/6（Cytokeratin 5/6,CK5/6）、細(xì)胞角蛋白7（Cytokeratin 7,CK7）及P63 免疫組織化學(xué)試劑均購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。按說明書步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 方法

1.3.1 TCT 取2 管胸腔積液，每管10 ml，3 000 r/min 離心5 min，棄上清液，每管加入約10 ml 細(xì)胞清洗液，繼續(xù)3 000 r/min 離心5 min，再棄上清液，在沉淀物中加入適量TCT 細(xì)胞保存液，置漩渦混合器上震蕩1 min 混勻，用德立森液基細(xì)胞儀制成薄層細(xì)胞涂片，95%乙醇固定15 min，巴氏染色。

1.3.2 細(xì)胞蠟塊的制作 取50 ml 胸腔積液，靜止沉淀1 h 后，吸取底部液體至離心管中，加入10%甲醛5 ml，離心棄上清液，重復(fù)1 次上述步驟后，用濾紙包裹，脫水、浸蠟及包埋后行4μm 厚連續(xù)切片。

1.3.3 免疫組織化學(xué) 常規(guī)切片后，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以試劑盒中提供的對照作為陰陽性對照，二氨基聯(lián)苯胺顯色。在細(xì)胞核、細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。由具有診斷資質(zhì)的病理醫(yī)師隨機(jī)觀察每張切片的5 個視野，每視野計數(shù) 100 個細(xì)胞。染色強(qiáng)度：0 分為無色，1 分為淺黃色或黃色，2 分為棕黃色。陽性細(xì)胞百分比：＜10%計0 分，10%～50%計1 分，＞50%計2 分，染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積＞2 為陽性，≤2 為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；繪制ROC 曲線，計算曲線下面積（area under the curve AUC），AUC＞0.5為該指標(biāo)有診斷價值，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 TCT 初診結(jié)果

鏡下細(xì)胞排列呈腺腔樣或桑葚樣（見圖1A、B），核異型性不明顯，核染色較深，核仁明顯，有時胞漿中出現(xiàn)黏液空泡。TCT 可初步診斷為可疑腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。鏡下細(xì)胞散在分布（見圖1C），細(xì)胞體積大小不一，形態(tài)多樣，細(xì)胞核大小不等，明顯畸形，核染色深。TCT 初步診斷為可疑腫瘤細(xì)胞或腫瘤 細(xì)胞。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

將TCT 篩查為可疑腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的胸腔積液，進(jìn)一步做石蠟包埋切片，并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。CK5/6、CK7 陽性顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，TTF-1、P63 蛋白陽性顆粒定位于細(xì)胞核。見圖2。

2.3 惡性胸腔積液中各免疫組織化學(xué)標(biāo)志物的陽性表達(dá)率比較

肺鱗癌和肺腺癌致惡性胸腔積液標(biāo)本中CK5/6、P63、TTF-1 及CK7 的陽性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖1 TCT 初診的腫瘤細(xì)胞 （巴氏染色）

圖2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

表1 惡性胸腔積液中各免疫組織化學(xué)標(biāo)志物的陽性表達(dá)率比較 例（%）

2.4 各免疫組織化學(xué)標(biāo)志物在惡性胸腔積液中的鑒別診斷

在肺鱗癌和腺癌所致惡性胸腔積液的鑒別診斷中，CK5/6 敏感性、特異性較高，分別為92.86%和89.58%；P63 敏感性較高而特異性一般，分別為91.67%和72.73%；TTF-1 敏感性、特異性較高，分別為87.18%和90.63%；CK7 敏感性較高而特異性一般，分別為94.23%和75.00%。見表2。

2.5 各免疫組織化學(xué)標(biāo)志物的ROC 曲線及曲線下面積

CK5/6、P63 診斷肺鱗癌所致惡性胸腔積液的ROC 曲線下面積分別為0.805 和0.755；TTF-1、CK7診斷肺腺癌所致惡性胸腔積液的ROC 曲線下面積分別為0.821 和0.774。見圖3。

表2 各免疫組織化學(xué)標(biāo)志物在惡性胸腔積液中的鑒別診斷參數(shù)

圖3 各免疫組織化學(xué)標(biāo)志物診斷惡性胸水的ROC 曲線

3 討論

隨著惡性腫瘤發(fā)病率的不斷升高，臨床上伴有惡性胸腔積液的患者也在逐漸增多。NSCLC 是產(chǎn)生惡性胸腔積液的主要原因，NSCLC 的愈后差，5年生存率只有13%，早期發(fā)現(xiàn)并明確診斷十分重要。目前，惡性胸腔積液的診斷與鑒別診斷是臨床和細(xì)胞學(xué)共同面臨的難題，雖然組織病理學(xué)檢查是金標(biāo)準(zhǔn)，但并不是所有患者都能接受這種有創(chuàng)檢查，所以手術(shù)或穿刺活檢并不適合所有伴有胸腔積液的癌癥患者。對于惡性胸腔積液，細(xì)胞病理學(xué)檢查顯得尤為重要，尤其是年老體弱無法獲得活檢組織的患者。劉芳等[3]研究顯示，漿膜腔積液細(xì)胞形態(tài)學(xué)聯(lián)合免疫組化染色，補(bǔ)充和發(fā)展了細(xì)胞病理學(xué)對疾病的準(zhǔn)確診斷，提高腫瘤細(xì)胞的檢出率。錢紅等[4]指出CTC 聯(lián)合胸水細(xì)胞沉渣石蠟切片及免疫組織化學(xué)，既可提高確診率，也可減少不必要的檢查，具有很高的臨床應(yīng)用價值。

TCT 是目前國際領(lǐng)先的脫落細(xì)胞檢查新技術(shù)。胸腔積液利用TCT 制片，把細(xì)胞集中到直徑為2 cm 范圍內(nèi)，涂片背景干凈，紅細(xì)胞被破壞掉，細(xì)胞分布均勻，結(jié)構(gòu)特別清晰。TCT 優(yōu)化了標(biāo)本制作，提高了制片質(zhì)量，改善了觀察效果；細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，三維立體感突出，易于識別，明確診斷。根據(jù)TCT 檢查結(jié)果，可初步篩選出惡性和可疑惡性的胸腔積液標(biāo)本，但對由NSCLC致胸腔積液進(jìn)行分型診斷，還需進(jìn)一步做免疫組織化學(xué)染色。

CK5/6 主要表達(dá)鱗狀上皮的基底細(xì)胞，P63 表達(dá)于復(fù)層上皮細(xì)胞及多個器官的基底層細(xì)胞中，可用于肺鱗癌和肺腺癌的鑒別診斷。本研究顯示CK5/6和P63 在肺鱗癌致惡性胸水中呈高表達(dá)，而在肺腺癌致胸水中呈低表達(dá)，與MUKHOPADHYAY 等[5]的研究結(jié)果一致；CK5/6 和P63 診斷肺鱗癌致惡性胸水有較高的敏感性和特異性，與其他學(xué)者報道P63 獨(dú)立診斷肺鱗癌的敏感性為90%～100%，特異性為68%～96%相符[6-8]；且CK5/6 和P63 的AUC 為0.805和0.755，進(jìn)一步證明CK5/6 和P63 可以作為肺鱗癌致惡性胸水的生物標(biāo)志物。

TTF-1 在原發(fā)性肺惡性腫瘤中主要表達(dá)于肺腺癌，在其他組織類型的肺癌中表達(dá)較少甚至不表達(dá)，CK7 多在卵巢、肺及乳腺的上皮細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，主要標(biāo)記于腺上皮和移行上皮，在鱗狀上皮不表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，TTF-1 和CK7 在肺腺癌所致的惡性胸水中呈高表達(dá)，而在肺鱗癌所致的胸腔積液中呈低表達(dá)；TTF-1 和CK7 診斷肺腺癌所致的惡性胸腔積液的敏感性、特異性較高，且AUC 較高，進(jìn)一步說明TTF-1和CK7 診斷肺腺癌致惡性胸腔積液的價值較高，說明TTF-1 和CK7 可以作為肺腺癌致惡性胸腔積液的生物標(biāo)志物，這與余何等[9]的結(jié)果相符。

綜上所述，在惡性胸腔積液中，運(yùn)用TCT 聯(lián)合免疫組織化學(xué)染色檢測，對于良惡性胸腔積液的鑒別診斷及NSCLC 致惡性積液的分型診斷，具有較好臨床應(yīng)用價值，這與鄒萍等[10]研究顯示TCT 聯(lián)合細(xì)胞免疫組織化學(xué)能夠準(zhǔn)確判斷腫瘤病理學(xué)分型的結(jié)論相一致，值得在臨床細(xì)胞病理學(xué)診斷工作中推廣應(yīng)用。