宋秀道，毛晨梅，馬錦

（1.南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州大學附屬兒童醫(yī)院 藥劑科，江蘇 蘇州 215025）

白楊素是黃芩、南棗酸及木蝴蝶等中藥的活性成分，也是一種廣泛存在于蜂膠、蜂蜜、西番蓮藍莓及其他膳食植物提取物中的黃酮類化合物，具有多種藥理作用，且不良反應小，毒性低[1]。在多種腫瘤細胞系和動物腫瘤模型中，白楊素具有抗腫瘤與化療增敏作用[2-3]。本研究通過白楊素增強5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）對人肝癌Bel-7402 細胞凋亡的誘導作用，提高5-FU 化療的敏感性，減少5-FU 的使用量與毒副反應，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 人肝癌Bel-7402 細胞株由蘇州大學生命科學學院惠贈，白楊素（純度99%）和5-FU（純度99%）購自北京百靈威科技有限公司，MTT 購自美國Sigma 公司，BCA 蛋白濃度測定試劑盒、二甲基亞砜（dimethylsurfoxide,DMSO）、胎牛血清及β-actin 單克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司，DMEM 培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司，0.25%胰蛋白酶液購自上海閃晶生物公司，Annexin V-FITC 凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，碘化丙啶（propidium iodide,PI）染液購自美國Sigma 公司，苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）裂解液購自上海源聚生物科技有限公司，ECL Plus 超敏發(fā)光液購自北京Solarbio 公司，山羊抗兔二抗購自美國CMCTAG 公司，B 細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）、Bcl-2 相關死亡啟動因子（Bcl-2 associated death promoter,Bad）及半胱氨酸蛋白酶蛋白-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.1.2 儀器 全自動酶標儀（550 型）和垂直電泳儀（Mini-P3）購自美國Bio-Rad 公司，MoFlo XDP型超速流式細胞分選系統(tǒng)購自美國Beckman Coulter公司，DYCZ-40B 型轉膜儀購自北京六一儀器廠，Centrifuge 5810R 冷凍高速離心機購自德國Eppendorf公司，AlphaImager HP 化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國ProteinSimple 公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法檢測細胞活力人肝癌Bel-7402 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基置于5%二氧化碳CO2、37℃飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數生長期人肝癌Bel-7402 細胞制成細胞懸液，調整細胞密度并接種于96 孔細胞培養(yǎng)板（1.2×104～1.5×104個/孔），于恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入100μl 白楊素的培養(yǎng)基（終濃度為100μmol/L），空白對照組不加藥；培養(yǎng)24 h 后，吸出培養(yǎng)液后，加入含5-FU 終濃度為0.0、12.5、25.0 及50.0μg/ml 培養(yǎng)基作用48 h，每組設6 個復孔。每組依次加入白楊素終濃度為50、100、150、200 及250μmol/L 的培養(yǎng)基作用48 h，空白對照組不加藥。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄上清液，每孔加入150μl DMSO，震蕩10 min 以使結晶物充分溶解，測定490 nm 處吸光度（optical density,OD）值。計算各組細胞存活率：細胞存活率（%）=實驗組OD/空白對照組OD×100%。實驗重復3 次。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡與周期 取對數生長期人肝癌Bel-7402 細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為1×105～2×105個/ml，接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，2 ml/孔。于恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜后，加入含100μmol/L 白楊素培養(yǎng)基（空白對照組為正常培養(yǎng)基）作用24 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入25μg/ml 5-FU作用48 h；然后用0.25%胰酶（不含乙二胺四乙酸）消化收集細胞，1 000 r/min 離心5 min，冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）漂洗2 遍。設立白楊素單獨組（100μmol/L 白楊素）、5-FU 單獨組（25μmol/L 5-FU）、白楊素聯(lián)合5-FU組（100μmol/L 白楊素+25μmol/L 5-FU）。細胞凋亡檢測：先加105μl 含Annexin V-FITC 的結合緩沖液重懸細胞，混勻后室溫避光染色10 min，再加5μl PI 染液，室溫避光染色5 min，流式細胞儀上樣檢測（激發(fā)波長/發(fā)射波長為488 nm/530 nm），獲得細胞凋亡率，實驗重復3 次。細胞周期檢測：流式管內緩慢加入-20℃預冷的70%乙醇，重新懸浮細胞，避光30 min，4℃條件下PBS 洗滌后以1 000 r/min 離心5 min，加入500μl PI 工作液，室溫避光30 min，用流式細胞儀進行檢測，獲得各組細胞有關增殖周期時相的數據，實驗重復3 次。

1.2.3 Western blotting 檢測蛋白表達 取對數生長期人肝癌Bel-7402 細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為1×105個/ml，接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，2 ml/孔，于恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜后，加入含100μmol/L 白楊素培養(yǎng)基（對照組為正常培養(yǎng)基）作用24 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入25μg/ml 5-FU 作用48 h；然后用0.25%胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，冷PBS 漂洗1 遍，收集細胞。收集的細胞加入1 mmol/L PMSF裂解液100μl，吹打均勻置于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min 離心30 min，取蛋白上清液，BCA 法檢測蛋白濃度，剩余蛋白與上樣緩沖液按比例混勻，沸水浴5 min，-80℃保存。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中進行蛋白分離，4℃條件下轉至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST 洗滌4 次，加入相應的二抗，孵育2 h 后，TBST 洗4 次，ECL 化學發(fā)光顯色，成像系統(tǒng)照相，用Image-J 軟件進行圖片分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或析因設計的方差分析，進一步兩兩比較用Turkey's 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白楊素增強5-FU 對人肝癌Bel-7402 細胞活力的抑制作用

MTT 法篩選實驗顯示，白楊素在0、50、100、150、200 及250μmol/L 濃度下作用肝癌BEL-7402 細胞48 h，細胞存活率分別為（100.00±0.000）%、（92.982± 5.313）%、（82.261±7.793）%、（62.423±6.082）%、（50.022±5.454）%和（42.372±4.564）%，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=56.724，P=0.000）；白楊素濃度為100、150、200 及250μmol/L 時肝癌BEL-7402 細胞的存活率低于空白對照組（0μmol/L 白楊素）（P＜0.05）。見圖1。

將100μmol/L 白楊素預處理人肝癌Bel-7402細胞24 h 后不出現(xiàn)細胞活力抑制作用的劑量用于研究白楊素對5-FU 誘導人肝癌Bel-7402 細胞凋亡是否有增強作用。各組細胞存活率比較，經析因設計的方差分析，處理因素白楊素的主效應比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=159.124，P=0.000）；處理因素5-FU 的主效應比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=81.933，P=0.000）；兩者交互作用比較，差異無統(tǒng)計學意義（F=2.768，P=0.0756）。無論是否進行白楊素預處理，人肝癌Bel-7402 細胞活力隨5-FU 濃度增加而降低。100μmol/L 白楊素預處理24 h 能增強5-FU 對人肝癌Bel-7402 細胞活力的抑制作用。見表1和圖2。

圖1 不同濃度白楊素作用人肝癌Bel-7402 細胞48 h 后的細胞活力 （±s）

表1 兩組不同濃度人肝癌Bel-7402 細胞活力的抑制作用 （n =3，%，±s）

表1 兩組不同濃度人肝癌Bel-7402 細胞活力的抑制作用 （n =3，%，±s）

注：①與0.0μg/ml 5-FU 比較，P ＜0.05；②與空白對照組比較，P ＜0.05。

組別 0.0μg/ml 5-FU 12.5μg/ml 5-FU 25.0μg/ml 5-FU 50.0μg/ml 5-FU空白對照組 100.000±0.000 88.983±1.414 71.442±2.014① 50.224±5.323①100μmol/L 白楊素組 90.694±4.426 71.644±3.816①② 47.116±6.117①② 34.214±7.637①②

圖2 兩組不同濃度5-FU 作用人肝癌Bel-7402 細胞的 存活率比較 （±s）

2.2 白楊素增強5-FU 對人肝癌Bel-7402 細胞凋亡的誘導作用

空白對照組細胞凋亡率為（4.15±0.88）%、白楊素單獨組為（13.32±1.33）%、5-FU 單獨組為（22.98±4.32）%，白楊素聯(lián)合5-FU組為（45.22±5.65）%。各組細胞凋亡率比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=70.234，P=0.000）；5-FU 單獨組細胞凋亡率較空白對照組高（P＜0.05）；白楊素單獨組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；白楊素聯(lián)合5-FU組細胞凋亡率較5-FU 單獨組和白楊素單獨組高（P＜0.05）。100μmol/L 白楊素預處理24 h 可增強5-FU 誘導人肝癌Bel-7402 細胞凋亡的作用。見 圖3、4。

2.3 白楊素增強5-FU 對人肝癌Bel-7402 細胞G2/M 期阻滯的誘導作用

圖3 各組流式細胞儀檢測結果

圖4 各組細胞凋亡率比較 （±s）

用PI 單染法檢測人肝癌Bel-7402 細胞周期分布情況，空白對照組[G0/G1 期：（85.35±2.61）%，G2/M 期：（3.66±0.68）%]；白楊素單獨組[（G0/G1期：（80.92±4.34）%，G2/M 期：（8.06±1.05）%]；5-FU 單獨組[（G0/G1 期：（73.54±5.49）%，G2/M 期：（12.67±2.28）%]；白楊素聯(lián)合5-FU組[（G0/G1 期：（55.47±3.69）%，G2/M 期：（26.16±2.17）%]。各組人肝癌Bel-7402 細胞G0/G1 期細胞數比較，經析因設計的方差分析，處理因素白楊素主效應比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=60.012，P=0.000）；處理因素5-FU 主效應比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=21.881，P=0.0016）；兩者交互作用比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.042，P=0.022）。各組細胞G2/M 期細胞數比較，經析因設計的方差分析，處理因素白楊素的主效應比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=192.212，P=0.000）；處理因素5-FU 的主效應比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=83.693，P=0.000）；兩者交互作用比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=21.610，P=0.0016）。100μmol/L 白楊素預處理24 h 可增強5-FU 對人肝癌Bel-7402 細胞發(fā)生G2/M 期阻滯。見圖5、6。

圖5 各組人肝癌Bel-7402 細胞周期分布情況

圖6 各組人肝癌Bel-7402 細胞G2/M 期的阻滯誘導作用比較 （±s）

2.4 白楊素對5-FU 處理人肝癌Bel-7402 細胞Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白表達的影響

各組Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；白楊素聯(lián)合5-FU組Bcl-2 蛋白相對表達量較白楊素單獨組和5-FU 單獨組低（P＜0.05），白楊素聯(lián)合5-FU組Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對表達量較白楊素單獨組和5-FU單獨組高（P＜0.05）。Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 表達增強或減弱可能是白楊素預處理24 h 加強5-FU 誘導人肝癌Bel-7402 細胞凋亡作用的機制之一。見表2和圖7。

表2 各組Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對表達情況 （±s）

表2 各組Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對表達情況 （±s）

組別 Bcl-2 Bax Bad Cleaved Caspase-3空白對照組 0.924±0.13 0.632±0.072 0.142±0.011 0.363±0.032白楊素單獨組 0.893±0.091 0.613±0.083 0.453±0.062 0.344±0.041 5-FU 單獨組 0.284±0.032 0.921±0.11 0.62±0.051 0.652±0.053白楊素聯(lián)合5-FU組 0.127±0.012 1.132±0.092 0.933±0.124 0.792±0.034 F 值 77.122 22.753 59.574 87.425 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖7 各組Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對表達量比較 （±s）

3 討論

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全世界發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，位于癌癥相關致死率的第2 位[4]。早期HCC 患者治療以手術切除和肝臟移植輔以化療為主，一般可取得滿意療效；但對于手術后復發(fā)、晚期有轉移及不能耐受手術的患者，化療已成為其治療主要手段[5]。5-FU 是臨床用于肝癌化療的一線藥物。在過去的20年中，5-FU 臨床療效肯定，但長期大劑量使用5-FU 產生的不良反應和耐藥性已影響其臨床療效，阻礙其進一步應 用[6-7]。因此，目前迫切的任務是尋找新的化合物來增強其化療敏感性，為臨床解決腫瘤耐藥性提供治療 方案。

誘導惡性腫瘤細胞凋亡是現(xiàn)代癌癥治療的主要目標之一。5-FU 等化療藥物發(fā)揮化療藥物毒性的最初作用形式是誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而細胞凋亡途徑異常是5-FU 發(fā)生耐藥的重要機制之一[8]。一般在臨床腫瘤化療中，為克服耐藥對化療效果的影響，提倡聯(lián)合用藥。流行病學研究證明，大量黃酮類化合物的攝入會降低多種腫瘤的發(fā)生風險[9-10]。黃酮類化合物因而被認為可用于腫瘤預防或臨床與化療藥物聯(lián)合應用。白楊素作為一種具有良好臨床應用前景的天然黃酮類化合物，已被證實可直接抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡[11]。近年來研究也報道，白楊素可與阿霉素[12]、順鉑[13]等不同化療藥物協(xié)同誘導腫瘤細胞凋亡與抑制腫瘤細胞增殖。本實驗結果顯示，100μmol/L 白楊素預處理24 h，人肝癌Bel-7402 細胞活力、凋亡和周期分布情況未受到影響。該濃度下的白楊素預處理24 h 可增強5-FU 抑制人肝癌Bel-7402細胞活力的作用，且100μmol/L 白楊素預處理人肝癌Bel-7402 細 胞24 h 后與12.5 和25.0μg/ml 5-FU聯(lián)用，人肝癌Bel-7402 細胞活力抑制效果分別優(yōu)于25 和50μg/ml 5-FU 單用，表明白楊素與5-FU 聯(lián)用的體外抑制人肝癌Bel-7402 細胞活力具有協(xié)同效應。100μmol/L 白楊素預處理24 h 可增強5-FU 誘導人肝癌Bel-7402 細胞凋亡的作用。細胞周期G2/M 期轉換在細胞周期進展及凋亡啟動中起重要作用。本實驗結果表明，100μmol/L 白楊素預處理24 h 可增強5-FU誘導人肝癌Bel-7402 細胞G2/M 期阻滯的作用，影響DNA 復制，使癌細胞分裂受阻，從而抑制細胞增殖。因此，白楊素可提高化療藥物5-FU 促進肝癌細胞凋亡的作用，具有作為化療增敏劑的應用前景。

目前細胞凋亡因啟動階段的不同可分為內源性線粒體通路和外源性死亡受體通路。Bcl-2家族基因是線粒體凋亡途徑的重要調控因子，通過調控線粒體膜的通透性，促進線粒體釋放細胞色素C 到胞質，啟動Caspase 級聯(lián)反應，如激活下游的凋亡效應因子Caspase-3，從而誘導細胞發(fā)生凋亡[14-15]。Bcl-2 高表達時，Bcl-2 可與Bax 形成異源二聚體，抑制細胞凋亡；Bax 或Bad 高表達時，細胞對死亡信號敏感可促發(fā)細胞凋亡過程。肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中Bcl-2家族抑凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax與Bad等表達異常，從而打破體內凋亡/抗凋亡的平衡，抑制多種化療藥物誘導的細胞凋亡，與肝癌對化療的耐藥發(fā)生有關[16]。本實驗結果顯示，100μmol/L 白楊素預處理24 h 可使5-FU 誘導人肝癌Bel-7402 細胞Cleaved Caspase-3、Bax 及Bad 蛋白表達水平上調，人肝癌Bcl-2 蛋白表達水平下調，表明白楊素預處理后，5-FU 誘導的人肝癌Bel-7402 細胞線粒體凋亡途徑更為活躍，促進細胞凋亡。白楊素對5-FU 誘導Bel-7402 細胞凋亡的增敏作用是否還與外源性死亡受體通路有關，有待進一步研究。

綜上所述，白楊素可增強5-FU 抑制人肝癌Bel-7402 細胞活力和誘導細胞凋亡的作用，下調Bcl-2 蛋白表達與上調Bax 和Bad 蛋白表達使線粒體凋亡通路激活可能是其重要的分子機制之一。白楊素對Bcl-2家族表達水平的調控是否與核轉錄因子（NF-κB）、非編碼RNA（microRNA）等有關，值得進一步研究。此外，筆者也將進一步研究白楊素是否能影響人肝癌Bel-7402 細胞對5-FU 的化療敏感性。