趙鑫 常穎 劉玉俠 王寶 盧衛(wèi)平 王啟文

(1吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；2吉林省腫瘤防治研究所)

手術(shù)、化療、放療是惡性腫瘤治療的常規(guī)手段。大多數(shù)惡性腫瘤病人需要進(jìn)行化療。隨著治療的進(jìn)行，大部分病人逐漸出現(xiàn)對(duì)化療藥物不敏感，即腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受，影響治療效果。本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞模型，并用細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)對(duì)其進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，為化療后腫瘤病人耐藥提供治療方法。

1 材料與方法

1.1材料 順鉑(cDDP)：江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；淋巴細(xì)胞分離液：天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司；IMDM培養(yǎng)基：GIBCO公司；胎牛血清：天津康源公司；白細(xì)胞介素(IL)-2：北京四環(huán)生物制藥有限公司；抗CD3抗體：Biolegend公司?？谷薈D3-FITC，抗人CD16、CD56-PE：BD公司；干擾素(IFN)-γ：天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司：噻唑藍(lán)(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)：Sigma公司。人食道癌細(xì)胞株Ecap-109：吉林省腫瘤防治研究所保存。

低溫高速離心機(jī)：SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱：Thermo Scientific公司；流式細(xì)胞儀：BD公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀：芬蘭雷勃公司。

1.2建立人食道癌細(xì)胞株Ecap-109耐藥模型 將凍存的Ecap-109細(xì)胞復(fù)蘇，放至細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加終濃度為50 μmol/L的cDDP至培養(yǎng)瓶，1 h后將含cDDP的培養(yǎng)液倒掉，換成新的不含cDDP的培養(yǎng)液，每天觀察細(xì)胞變化，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用0.25%胰酶消化后分瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，每瓶重新加入終濃度為50 μmol/L的cDDP，如此反復(fù)誘導(dǎo)6次后，做cDDP耐藥實(shí)驗(yàn)。

1.3耐藥實(shí)驗(yàn) 將誘導(dǎo)6次的Ecap-109 細(xì)胞和正常Ecap-109 細(xì)胞計(jì)數(shù)，均為5×104/ml，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μl/孔。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度(100.00，50.00，25.00，12.50，6.25 μmol/L)的cDDP，培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加MTT，培養(yǎng)結(jié)束，小心吸去上清，加150 μl DMSO，用酶標(biāo)儀測(cè)OD值，波長(zhǎng)492 nm，計(jì)算不同濃度cDDP對(duì)兩種細(xì)胞的抑制率，并計(jì)算誘導(dǎo)的耐藥細(xì)胞及正常細(xì)胞的IC50值和耐藥指數(shù)。

1.4CIK細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定 見參考文獻(xiàn)〔1〕。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件計(jì)算IC50，計(jì)量數(shù)據(jù)兩組比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CDDP對(duì)誘導(dǎo)的耐藥Ecap-109細(xì)胞和正常Ecap-109細(xì)胞的抑制率及IC50 見表1。CDDP誘導(dǎo)6次后的Ecap-109細(xì)胞對(duì)其抑制率明顯低于正常Ecap-109細(xì)胞，IC50值(70.869 μmol/L)也明顯高于正常Ecap-109細(xì)胞(20.561 μmol/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，耐藥指數(shù)達(dá)到了3.45。

2.2CIK對(duì)耐藥Ecap-109細(xì)胞和正常Ecap-109細(xì)胞殺傷活性 CIK組、CIK+耐藥Ecap-109組、耐藥Eap-109組、CIK+Ecap-109組、Ecap-109組的殺傷活性分別為：2.243±0.062，2.715±0.139，2.413 ±0.195，2.682±0.044，2.548±0.045。以上結(jié)果顯示，CIK細(xì)胞對(duì)耐藥Ecap-109細(xì)胞和正常Ecap-109細(xì)胞的殺傷活性(80.43%，83.0%)沒有顯著差別(P>0.05)，證明CIK細(xì)胞可以殺傷耐藥腫瘤細(xì)胞。

表1 耐藥Ecap-109細(xì)胞和正常Ecap-109細(xì)胞耐藥檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療等抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥是造成治療失敗的主要原因之一。針對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥，目前的處理對(duì)策包括尋找耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法、尋找ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑、促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡等〔2〕，采用的方法有使用腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑，如三苯氧胺、托瑞米芬、miRNA〔3，4〕等。

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的原因有多種，其中化療后殘存的腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是引起轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要原因之一〔5〕。CSCs如同其他干細(xì)胞一樣，具有無限自我更新能力，它就像一粒種子，在適合的條件下會(huì)無限增殖，而且會(huì)通過多種機(jī)制產(chǎn)生耐藥〔6〕。

食道癌是我國常見的惡性腫瘤之一，目前主要治療方法是手術(shù)、化療、放療等。同其他腫瘤一樣，在進(jìn)行手術(shù)后化療過程中，以及一部分晚期病人化療進(jìn)行中，部分病人隨著治療的進(jìn)行會(huì)產(chǎn)生對(duì)化療藥的耐藥，影響治療效果。

鉑類藥物是最常用的腫瘤化療藥物，所以由其引起的耐藥比較多，而且還會(huì)出現(xiàn)交叉耐藥。針對(duì)這一現(xiàn)狀，本文建立了食道癌耐cDDP的耐藥細(xì)胞株Ecap-109，以此為基礎(chǔ)，探討CIK細(xì)胞對(duì)耐藥細(xì)胞的殺傷作用。CIK是具有T淋巴細(xì)胞抗腫瘤活性和自然殺傷(NK)細(xì)胞無主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性的抗腫瘤細(xì)胞，它可以同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，又被稱為NK樣T淋巴細(xì)胞〔7，8〕，由于它的這些特征，它可以通過釋放腺病毒顆粒直接殺傷腫瘤，同時(shí)分泌抗腫瘤細(xì)胞因子IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-2等調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而間接殺傷腫瘤，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，保持持續(xù)抗腫瘤活性，目前對(duì)其抗腫瘤作用研究較多〔9〕。本研究結(jié)果說明CIK細(xì)胞可以用于耐藥腫瘤病人的治療。