黃仕美 楊小蓉 羅亞 汪忠保 汪元河

(1貴州醫(yī)科大學法醫(yī)學院法醫(yī)臨床學教研室，貴州 貴陽 550004；2貴州省黔西縣公安局)

老年性癡呆癥又叫阿爾茨海默病(AD)，該病的主要根源是神經(jīng)退行性改變，此類患者在行為上會表現(xiàn)出記憶能力變差、智力退化、性格和精神失常、與社會環(huán)境格格不入〔1〕。在外觀上的表現(xiàn)為老年斑、因持續(xù)累積的tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)及β-淀粉樣蛋白(Aβ)增加〔2〕。該疾病的病因及怎樣有效預防和治療暫時還沒有達成共識。鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶類中，對細胞外基質(zhì)蛋白產(chǎn)生降解作用的是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括帕金森病(PD)及AD在內(nèi)，其形成都與MMPs相關(guān)。該類酶將對應的細胞外基質(zhì)(ECM)進行分解，在各類細胞的病理及生理活動中對重組及水解兩個過程的平衡進行作用。此外，在人體出現(xiàn)炎癥時，MMPs的作用也是不可或缺的〔3，4〕。從神經(jīng)毒性來說，Aβ和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)存在著極大關(guān)聯(lián)。不僅如此，Aβ代謝活動在AD 患者體內(nèi)所維持的平衡狀態(tài)會隨相關(guān)金屬離子的狀態(tài)受 MMP-2作用產(chǎn)生的變化而發(fā)生改變，若AD所產(chǎn)生的作用存在于相關(guān)過程中，則該蛋白的活力水平必定會發(fā)生改變〔5〕。目前，基本上還沒有研究得出在AD的形成和治療過程中縫隙連接蛋白(CX)43和MMP-2、MMP-9的表達之間存在關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1實驗動物 雄性NIH小鼠40只，16～24 g。貴州醫(yī)科大學實驗動物中心無特定病原體(SPF)級環(huán)境飼養(yǎng)，經(jīng)實驗動物倫理委員會批準。

1.2試劑 D-半乳糖、亞硝酸鈉均為市售分析純；由上海生物工程有限公司設計生產(chǎn)MMP-9、CX43、MMP-2、β-actin定量聚合酶鏈反應(PCR)的引物；DL2000 DNA Marker購自日本TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix購自北京TIANGEN 公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)購自德國Roche公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜和超敏電化學發(fā)光試劑盒購自美國Amer-sham公司；封閉液、抗體稀釋液、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒及5×蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗CX43單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗MMP-2多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體、兔抗β-肌紅蛋白(β-actin)單克隆抗體購自上海Santa Cruz公司。

1.3動物分組及藥物處理 小鼠隨機分為正常對照組和模型組各10只。正常對照組皮下注射等體積生理鹽水，模型組皮下注射D-半乳糖(120 mg/kg)和亞硝酸鈉(90 mg/kg)，連續(xù)給藥60 d，建立癡呆小鼠模型〔6〕。完成注射后，將4%的0.2 ml/g水合氯醛注射進腹腔進行麻醉，剖開胸面，露出心臟，由左心室一直延伸到主動脈用穿刺針穿刺，使用40 ml pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)清潔血管床，持續(xù)5 min接著剝離大腦組織，-80℃儲存。

1.4實時熒光(RT)-PCR檢測β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43 mRNA表達水平 用Trizol一步法，提取海馬組織中RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43對應的引物序列見表1。采用ABI Step One Plus 型RT-PCR儀獲取β-actin、MMP-9、MMP-2及CX43的擴增信號采用SDS2.1軟件對數(shù)據(jù)進行分析及對熒光信息進行獲取。β-actin為內(nèi)參對照，對所得結(jié)果進行分析，RQ=2-ΔΔCt，該實驗重復3次。

表1 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物片段

1.5Western印跡法檢測MMP-9、MMP-2及CX43蛋白表達水平 向PMSF：放射免疫沉淀(RIPA)裂解液=1∶100的比例放入海馬組織，冷凍離心機4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液檢測目標蛋白質(zhì)。使用超微量紫外分光光度計N2000型檢測各樣品蛋白濃度，Image J軟件分析圖片灰度值，以β-actin蛋白為內(nèi)參，MMP9、MMP2、CX43的蛋白條帶相對內(nèi)參蛋白條帶灰度的比值為檢測蛋白的相對表達水平，重復3次。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

相比于正常對照組，模型組CX43、MMP-9 mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 兩組CX43、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表達水平

3 討 論

MMPs是一組降解細胞外基質(zhì)最主要的酶類〔7〕，1962年，Lapiere和Gross首次發(fā)現(xiàn)，在多種內(nèi)膚酶中存在著一系列根據(jù)鋅離子相關(guān)狀況來發(fā)揮功能的蛋白酶，也就是MMPs，除了神經(jīng)元，還有許多不同類型的細胞都能夠分泌此類蛋白酶，如淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞等〔8〕。一般來說，在人體傷口恢復和發(fā)育的過程中，MMPs所起到的作用是非常關(guān)鍵的，但若人體發(fā)生了某些疾病，MMPs所產(chǎn)生的作用對病情的發(fā)展十分不利，如AD或腦卒中等〔9，10〕。到目前為止，已有超過20種人體自帶的MMPs被發(fā)現(xiàn)〔11〕。

MMPs的種類較多，其中所起到的影響最大的就是能夠?qū)羽みB蛋白、彈性蛋白及明膠等進行分解的MMP-2和MMP-9，在發(fā)生水解后，神經(jīng)細胞會因?qū)羽みB蛋白的減少而遭到嚴重破壞甚至失活。研究表明，AD患者死亡后，解剖尸體發(fā)現(xiàn)MMP-9在大腦血管內(nèi)皮細胞及海馬體神經(jīng)元中呈高表達，因此神經(jīng)細胞難以實現(xiàn)膠原化。而在腦組織細胞中，MMP-2、MMP-9 的高表達可促進細胞凋亡，損害神經(jīng)元。Aβ屬于三磷酸腺苷(ATP)的分解產(chǎn)物，該物質(zhì)的降解可通過MMP-9來實現(xiàn)，這一點在體外實驗中已經(jīng)得到了驗證，此外，髓鞘堿性蛋白及細胞外基質(zhì)也會在MMP-9的作用下被徹底分解，更加嚴重地破壞患者腦部組織〔8〕。信息交流在細胞中的實現(xiàn)主要依靠縫隙連接(GJ)，包括環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、三磷酸肌醇(IP3)及ATP在內(nèi)的部分小分子氨基酸等小分子物質(zhì)及離子等能夠穿過其中，該結(jié)構(gòu)由兩個半通道相連而成，主要物質(zhì)為CX，其具有特殊性質(zhì)。在血腦屏障精細結(jié)構(gòu)的組成中CX43是組成星形膠質(zhì)細胞縫隙的主要物質(zhì)，該類結(jié)構(gòu)多存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中?？p隙的信息交流水平極大程度上取決于CX43的表達程度，這一點在包括骨髓損傷在內(nèi)的部分神經(jīng)病理性疼痛模型中有所體現(xiàn)〔12〕。

雖然NFT及老年斑因Aβ沉積而增多是引發(fā)AD的關(guān)鍵原因，但AD是一個多因素相互作用的疾病〔13〕。本實驗結(jié)果提示CX43及MMP-9表達紊亂在AD小鼠的發(fā)病機制中可能起著重要作用。