袁世洋 賀榮芝 謝軍平 劉川 盛天樂 蔡婧 李里香 鄒葉青

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1江西省分子醫(yī)學(xué)重點實驗室，南昌 330006；2呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；3病理科；4腫瘤科)

約80%以上肺癌是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，在全世界范圍內(nèi)，肺癌已成為癌癥致死的主要原因之一〔1〕。中國晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識(2016年版)〔2〕指出：“推薦所有病理診斷為肺腺癌、含有腺癌成分和具有腺癌分化的NSCLC患者進(jìn)行表皮生長因子受體(EGFR)基因突變檢測，建議對小活檢標(biāo)本診斷的或不吸煙的鱗癌患者也進(jìn)行檢測，如果腫瘤標(biāo)本不可評估，可從血液(血漿)標(biāo)本中獲得循環(huán)腫瘤(ct)DNA進(jìn)行評估”。目前，EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的分子靶向治療已成為具有EGFR敏感突變的NSCLC患者的一線治療方案。據(jù)報道，不同EGFR基因突變類型對EGFR-TKI的臨床療效不同〔3～6〕。因此，對于NSCLC患者，臨床醫(yī)生不僅需要了解該患者是否具有EGFR基因突變，還需要了解具體突變類型。由于基因突變檢測費(fèi)用相對較高且需要肺穿刺取材，目前也有相當(dāng)一部分患者在未經(jīng)EGFR基因檢測前嘗試EGFR-TKI的治療。本研究擬探討NSCLC患者EGFR基因突變情況。

1 資料和方法

1.1一般資料 收集2013年12月至2018年3月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢測EGFR基因突變且未經(jīng)EGFR-TKI治療的NSCLC組織標(biāo)本及對應(yīng)的臨床資料〔包括年齡、性別、癌胚抗原(CEA)、肺癌病理類型、臨床TNM分期、合并的基礎(chǔ)疾病等〕。共收集并匹配到相應(yīng)臨床資料病例673例，男400例，女273例，平均年齡(61.2±10.7)歲。經(jīng)手術(shù)獲取的組織石蠟包埋樣本94例，經(jīng)皮肺穿刺獲取的組織石蠟包埋樣本479例，纖維支氣管鏡獲取的組織石蠟包埋樣本90例，經(jīng)淋巴結(jié)穿刺及胸膜活檢獲取的組織石蠟包埋樣本10例。腺癌616例，鱗狀細(xì)胞癌39例，肺腺鱗癌7例，大細(xì)胞肺癌、未定型的NSCLC及含腺成分的混合型肺癌11例。

1.2儀器與試劑 ABI7500實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國life公司)，樣本的DNA抽提試劑盒及EGFR基因突變檢測試劑盒均購自廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司。

1.3石蠟樣本的脫蠟及DNA抽提 每例石蠟包埋樣本選取5～10片，置于1.5 ml離心管中，使用二甲苯、無水乙醇進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理后沉淀、烘干；采用AmoyDx?甲醛溶液固定和石蠟包埋樣本DNA分離試劑盒(離心柱型)，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書提取DNA。

1.4突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(ARMS)-PCR法檢測EGFR基因突變 試劑盒采用PCR管設(shè)計，雙探針，ABI7500儀器檢測，檢測位點為包含19-Del、L858R、T790M、20-Ins、G719X、S768I、L861Q。每個PCR反應(yīng)管內(nèi)均含有5～10 pmol/L特異性引物、20 pmol/L雙環(huán)探針、12.5 μmol/L三磷酸堿基脫氧核苷酸、175 μmol/L氯化鎂、1 mmol/L硫酸銨、2.5 mmol/L氯化鉀和純化水等。42℃ 5 min，94℃ 3 min，94℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個循環(huán)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、多因素Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC患者EGFR基因突變情況 共檢出330例EGFR基因陽性突變，總體突變率為49.0%。19-Del 168例(50.9%)，L858R 122例(37.0%)，S768I 2例(0.6%)，G719X 3例(0.9%)，L861Q無檢出，T790M 2例(0.6%)，20ins 5例(1.5%)，19-Del+L858R 8例(2.4%)，19-Del+T790M 5例(1.5%)，G719X+L861Q 2例(0.6%)，G719X+S768I 2例(0.6%)，L858R+T790M 10例(3.0%)，T790M+20ins 1例(0.3%)。在所有突變類型中，以敏感性突變19-Del、L858R為主，占總體突變的87.9%(290/330)，明顯高于其他突變類型。19-Del突變率顯著高于L858R(P<0.001)。

2.2NSCLC患者EGFR基因突變與臨床特點 EGFR基因突變與患者性別、年齡、吸煙史、病理類型及CEA水平相關(guān)(P<0.01、P<0.001)，與臨床分期無關(guān)(P>0.05)，見表1。不吸煙的女性患者EGFR基因突變率高達(dá)69.3%(185/267)。CEA陽性不吸煙女性肺腺癌患者EGFR基因突變率高達(dá)78.3%(130/166)。而大細(xì)胞肺癌患者中未發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變。

表1 EGFR基因突變患者臨床特點〔n(%)〕

2.3NSCLC患者EGFR基因突變的多因素Logistic回歸分析 病理類型、CEA水平、年齡、性別是EGFR基因突變的預(yù)測因素，而吸煙史和臨床分期和EGFR突變不存在明顯相關(guān)性。見表2。

2.4NSCLC患者EGFR基因突變與合并基礎(chǔ)疾病的關(guān)系 共175例合并基礎(chǔ)疾病，冠心病4例，支氣管擴(kuò)張3例，哮喘1例，高血壓、慢性支氣管炎混合10例，高血壓、肺結(jié)核混合6例，高血壓、冠心病混合1例。與未合并基礎(chǔ)疾病的患者相比，合并單一糖尿病的患者EGFR L858R突變率顯著升高(P=0.001)。而合并單一糖尿病的患者19-Del突變率未見明顯差異(P>0.05)。見表3。

表2 多因素Logistic回歸分析NSCLC患者EGFR基因突變的預(yù)測因素(n=673)

表3 NSCLC患者EGFR基因突變與合并基礎(chǔ)疾病的相關(guān)性〔n(%)〕

與無基礎(chǔ)疾病比較：1)P<0.01；2)未納入合并基礎(chǔ)疾病≤10例患者

3 討 論

EGFR基因是NSCLC極為重要的驅(qū)動基因之一，常見突變19-Del、L858R和罕見突變S768I，G719S、L861Q為EGFR-TKI的敏感型突變，T790M和20ins為耐藥型突變〔7〕。多項臨床研究結(jié)果顯示，和標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案相比，對有EGFR基因敏感突變的NSCLC患者接受EGFR-TKI(吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼)靶向治療可獲得顯著提高治療效果及無進(jìn)展生存期及良好的耐受性〔8～10〕。既往DNA直接測序作為EGFR基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法對檢測樣本要求高(突變細(xì)胞占總標(biāo)本的20%以上)，且靈敏度低，容易漏檢部分突變標(biāo)本。而ARMS法可檢測出含1%突變細(xì)胞的標(biāo)本，其敏感度高〔11〕。本研究結(jié)果和既往報道亞裔和中國人群EGFR基因突變率基本相似〔12，13〕。地區(qū)不同，EGFR總體突變率及主要突變類型存在差異，如宣威、福州地區(qū)以21號外顯子L858R突變?yōu)橹?，而廣西地區(qū)以19-Del突變?yōu)橹鳌?4～16〕。本研究19-Del突變率高于L858R。

在本研究中，女性、肺腺癌患者的EGFR基因突變明顯高于男性、非腺癌患者，和既往的相關(guān)報道結(jié)果一致〔17，18〕。年齡是否和NSCLC患者EGFR基因突變具有相關(guān)性，目前尚無定論。Sacher等〔19〕納入2 237例NSCLC患者，分析年齡與EGFR、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)、V-raf鼠肉瘤素原癌基因同源基因B(BRAF)-V600E及K鼠肉瘤病毒基因(KRAS)等基因突變狀態(tài)的相關(guān)性，多因素Lgoistic回歸分析結(jié)果顯示，EGFR和ALK基因突變和更小的年齡相關(guān)。Tjulandin等〔20〕的研究共納入838例NSCLC患者，EGFR基因突變率為10.1%，多因素Logistic分析模型結(jié)果同樣顯示了年齡是EGFR基因突變的獨(dú)立預(yù)測因子，低于60歲的NSCLC患者EGFR基因突變率更高。而國內(nèi)有多項研究結(jié)果顯示EGFR基因突變狀態(tài)和年齡不存在相關(guān)性〔16，21，22〕。本研究多因素Logistic分析模型結(jié)果顯示，EGFR基因突變和年齡相關(guān)，年齡低于60歲是EGFR基因突變的預(yù)測因子。

目前認(rèn)為，吸煙是EGFR基因突變與否的預(yù)測因子之一〔23〕。在本研究中，單因素分析結(jié)果顯示吸煙狀態(tài)是EGFR基因突變的預(yù)測因素，但并未進(jìn)入多因素回歸模型。其原因可能是吸煙和其他因素產(chǎn)生交互效應(yīng)。此外，這也是回顧性分析的不足之處，僅根據(jù)病例資料，無法準(zhǔn)確得到每一例患者的吸煙狀態(tài)。而且，女性存在油煙、二手煙等吸入情況，大部分病例資料也未能提及。

血清或胸水CEA水平和EGFR基因突變狀態(tài)密切相關(guān)，目前這一觀點已被國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)可〔24～27〕。CEA水平能預(yù)測EGFR基因突變與否的原因可能在于EGFR基因突變時激活下游轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，破壞細(xì)胞凋亡機(jī)制的同時引起CEA蛋白表達(dá)增加〔28〕。EGFR基因突變可能和基礎(chǔ)疾病存在相關(guān)性，如高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病引起腫瘤微環(huán)境的變化導(dǎo)致EGFR基因突變差異目前尚未能知，值得進(jìn)一步探討。Hakonen等〔29〕研究結(jié)果說明了EGFR L858R突變與糖尿病的潛在聯(lián)系，其通過在胰島素啟動子下建立EGFR L858R表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，探討在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，EGFR激活是否觸發(fā)對糖尿病Beta細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。結(jié)果顯示EGFR L858R可能通過抑制促凋亡蛋白BCL2-Like 11(BIM)表達(dá)保護(hù)胰島細(xì)胞因子介導(dǎo)的Beta細(xì)胞凋亡。但目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)2型糖尿病與NSCLC患者EGFR突變存在直接相關(guān)性的研究。而本研究收集到合并單一糖尿病的NSCLC患者數(shù)較少，需大樣本的前瞻性研究進(jìn)行驗證。