楊志鵬，王建彬，文婷婷，韓墨，趙鑫君，張晶晶，王婷，*

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南250353；2.諸城東曉生物科技有限公司，山東諸城262200；3.山東省種子管理總站，山東濟南250353）

自由基是維持正常生命所必需的物質，同時也是大分子、細胞的“危險殺手”。自Harman 首次提出衰老的自由基氧化應激學說以來，經(jīng)過60 多年的發(fā)展，自由基氧化應激學說越來越被人群所接受，許多老齡化疾病的發(fā)病機制都與機體參與氧化應激有關[1]。究其原因，很大一方面是由于機體長期處于應激狀態(tài)時，體內氧自由基的產(chǎn)生過多或清除自由基的酶類產(chǎn)生減少，氧自由基的產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞，機體內部自由基清除能力減弱，導致細胞結構和功能的破壞，從而引起疾病和衰老[2-3]。果蔬中富含多種天然的抗氧化活性物質，如多酚類的白藜蘆醇、黃酮類的蘆丁、維生素C（抗壞血酸）、維生素B2（核黃素）、類胡蘿卜素等，以及近期研究發(fā)現(xiàn)的番茄紅素（lycopene）、類黃酮（flavonoids）及花青素（anthocyanin），以上物質均具有清除含氧自由基，調節(jié)機體內平衡，提高免疫力，延緩衰老的功能[4]。

酵素是指以動物、植物、菌類等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品，其包含了天然營養(yǎng)物質、酶、有益微生物及其活性代謝物[5]。酵素產(chǎn)品日趨火熱，也體現(xiàn)了大眾認識到合理飲食對健康的重要性，但是目前對于功能性明確的酵素產(chǎn)品研究較少。精選天然抗氧化能力強的果蔬為原料，經(jīng)益生菌分解和代謝，釋放出其所含原花青素、多酚、維生素等天然功效成分，可直接參與人體新陳代謝，通過阻斷自由基鏈反應，減少自由基的產(chǎn)生或清除自由基等形式提高機體的抗氧化能力，并具有潛在的抗炎、免疫調節(jié)和延緩機體衰老的功效[6-8]。因此，通過開發(fā)具有抗氧化功能的復合果蔬酵素并對其中天然活性成分進行研究，對開發(fā)具有潛在調節(jié)人體腸道菌群，防止脂質過氧化反應，清除體內自由基，延緩衰老、提高機體免疫力的功能食品具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠李糖乳桿菌 217-1、217-3、217-8 為齊魯工業(yè)大學生物制藥工程研究所保藏菌株[9]。

1.2 設備

RS232-C 分光光度計：上海元析儀器有限公司；UV-5500PC 離心機：湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司；DJ1-012 打漿機：靖江舜天工業(yè)設備制造有限公司；LDZX-50KB 滅菌鍋：上海復昌科技有限公司；SHP-150恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；FE20 酸度計：武漢永勝科技有限公司；LC-VP 高效液相色譜：日本島津公司。

1.3 試劑和材料

乳酸菌培養(yǎng)基（Lactobacilli MRS broth）：海博生物有限公司；氯化鈉、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、葡萄糖、茚三酮、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、沒食子酸、碳酸鈉、福林酚試劑、鹽酸、硫酸鐵銨、正丁醇、異丙醇、甲酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；DPPH：Sigma 公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津富宇精細化工有限公司；核黃素（維生素B2）標準品、原花青素標準品：上海源葉生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 抗氧化復合果蔬酵素的制備

選取檸檬、蘋果、桑葚、菠蘿、草莓、番茄等多種果蔬，清洗潔凈后打漿。加入果膠酶酶解并調節(jié)pH 值為5～7，后 105 ℃滅菌 20 min。待溫度降為 25 ℃～35 ℃時加入鼠李糖乳桿菌217-1、217-3 和217-8 進行37 ℃恒溫發(fā)酵。酵素于超凈工作臺混勻后取樣，后4 000 r/min 離心10 min，取上清液，待測。對照原溶液為果蔬打漿、酶解并調節(jié)pH 值后，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，待測。

1.4.2 抗氧化果蔬酵素活菌數(shù)與pH 值的檢測

采用平板計數(shù)法和pH 計分別檢測酵素發(fā)酵階段乳酸菌和pH 值的變化[5]。

接入乳酸菌后，從0 h 開始，每隔5 h 對酵素取樣一次，持續(xù)10 次。于超凈工作臺中對一定量樣品進行梯度稀釋，后取適宜濃度梯度的酵素稀釋液涂布于MRS 平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h。取樣品用pH 計檢測酵素中的pH 值。

1.4.3 抗氧化果蔬酵素總糖含量的檢測

采用苯酚-硫酸法檢測酵素中的總糖含量[10]。

準確分別吸取100 mg/L 的葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于試管中并用蒸餾水補至 1.0 mL。向試管中加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL 硫酸，靜置10 min。渦旋振蕩器使反應液充分混合，將試管放置于30 ℃水浴中反應20 min，490 nm 測吸光度。取1.0 mL的待測樣品重復上述操作，測定其吸光度，計算樣品的總糖含量。

1.4.4 抗氧化果蔬酵素多酚含量的檢測

采用福林酚試劑法檢測酵素中多酚含量[11]。

取沒食子酸標準溶液配制 10、20、30、40、50 μg/mL的沒食子酸工作液。分別取沒食子酸工作液和蒸餾水各1 mL 于試管中，加入5.0 mL 10%福林酚試劑，反應5 min 后加入7.5%的Na2CO3溶液4 mL，搖勻后25 ℃放置60 min，于765 nm 波長下測定吸光度。取1.0 mL的待測樣品重復上述操作，測定其吸光度，計算樣品中多酚含量。

1.4.5 抗氧化果蔬酵素黃酮含量的檢測

分別吸取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 蘆丁標準液于10 mL 容量瓶中，加入0.15 mL 質量分數(shù)為5%的NaNO2溶液，混勻放置6 min。加10%的Al（NO3）3溶液0.15mL，搖勻放置6min。最后加入2 mL 4%的NaOH 溶液，以甲醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，于510 nm波長下測定吸光度[12]。取1.0 mL 的待測樣品用甲醇定容于10 mL 容量瓶中，后取1 mL 提取液重復上述操作，測定其吸光度，計算樣品中總黃酮含量。

1.4.6 抗氧化果蔬酵素核黃素的檢測

采用高效液相色譜法檢測酵素中核黃素的含量[13]。

取核黃素標準儲備液混合、稀釋、定容配制成質量濃度為100 μg/mL 的核黃素標準溶液，以此標準溶液為最高濃度稀釋成系列標準溶液。分別以進樣濃度為橫坐標（X）、峰面積積分值（Y）為縱坐標繪制標準曲線并計算回歸方程。同時吸取酵素樣品進行液相色譜分析，根據(jù)標準曲線計算酵素中核黃素的含量。

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 A：25 mmol/L 磷酸二氫鉀緩沖液，B：乙腈；梯度洗脫條件：起始 5 min 內 100%A 洗脫，隨后20 min 內A 相體積比由100%線性下降至75 %，保持5 min 后，恢復至100 % A 平衡色譜柱10 min；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣器溫度：4 ℃；進樣體積：20 μL；采集波長設定為 267 nm。

1.4.7 抗氧化果蔬酵素原花青素的研究

采用GB/T 22244-2008《保健食品中前花青素的測定》測定酵素中原花青素的含量。

液相條件為色譜柱：C18 柱；柱溫：35 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：525 nm；進樣量：10 μL；流動相（體積比）：水+甲醇+異丙醇+甲酸=73+13+6+8；流速：1.0 mL/min。

根據(jù)含量準確吸取1 mL～5 mL 樣液，置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。將正丁醇與濃鹽酸按95∶5 的體積比混合后，取出15 mL 置于具塞錐瓶中，再加入0.5 mL 硫酸鐵銨溶液和2 mL 試樣溶液，混勻，置沸水浴精確加熱40 min 后，立即置冰水中冷卻，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，進行高效液相色譜分析。

1.4.8 抗氧化果蔬酵素抗氧化性的研究

采用DPPH 自由基清除試驗模擬機體內清除自由基。

取100 μL 各稀釋梯度的樣品溶液加至試管中，然后向每管加入3.9 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，混勻，37 ℃避光水浴1 h 后于517 nm 下測定吸光度。以乙醇做空白對照，蒸餾水調零，每個樣品均平行測定3 次，結果以IC50值表示。IC50是指DPPH 自由基清除率為50%時所對應的樣品濃度[14]。DPPH 自由基清除率按下式計算：

式中：Ac 為空白對照管的吸光度；As 為樣品測定管的吸光度。

2 結果與分析

2.1 抗氧化復合果蔬酵素發(fā)酵時間的確定

復合抗氧化果蔬酵素中pH 值和活菌數(shù)變化曲線見圖1。

圖1 復合抗氧化果蔬酵素中pH 值和活菌數(shù)變化曲線Fig.1 Change curve of pH value and number of living bacteria in Jiaosu

由圖1 所示，在復合抗氧化果蔬酵素發(fā)酵過程中，0～5 h 乳酸菌處于延滯期，pH 值下降緩慢。5 h～25 h，乳酸菌處于對數(shù)期，鼠李糖乳桿菌快速增值，消耗C、N 源并產(chǎn)生大量的乳酸，pH 值由6.12 迅速下降至3.52。隨著乳酸的積累和營養(yǎng)消耗，25 h～45 h 鼠李糖乳桿菌進入穩(wěn)定期生長平穩(wěn)，乳酸生成減少，pH 值緩慢下降并穩(wěn)定在3.20 左右，因此將發(fā)酵時間確定為40 h～50 h。復合抗氧化果蔬酵素選用的鼠李糖乳桿菌217-1、217-3、217-8 分離于健康兒童的腸道菌群，經(jīng)體外益生評價試驗，具有顯著的酸、膽鹽、人工胃腸液耐受能力，同時高產(chǎn) γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和具備高效降膽固醇能力[9]。因此，以鼠李糖乳桿菌作為出發(fā)菌株發(fā)酵復合抗氧化果蔬，能夠有效的將果蔬中的大分子物質轉化為利于人體吸收利用的小分子成分，同時產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，調節(jié)人體腸道菌群平衡、促進細胞分裂能力，防止脂質過氧化反應，清除體內自由基，提高機體免疫力，起到排毒養(yǎng)顏、延緩衰老的作用[15]。

2.2 抗氧化復合果蔬酵素發(fā)酵階段總糖含量的變化趨勢

復合抗氧化果蔬酵素總糖含量的變化趨勢見圖2。

圖2 抗氧化果蔬酵素總糖含量變化曲線Fig.2 Change curve of total sugar content of Jiaosu

如圖2 所示，復合抗氧化果蔬酵素的初始總糖含量是120.5 mg/mL。發(fā)酵30 h 的時候，總糖為35.29 mg/mL。當發(fā)酵進行到50 h 左右的時候，總糖濃度下降到了24.37 mg/mL。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)表明：發(fā)酵初期糖代謝較為旺盛，鼠李糖乳桿菌快速增值，是產(chǎn)生乳酸的關鍵時期。在發(fā)酵后期隨菌株的生長受到抑制，糖代謝減緩，糖的利用率下降。

2.3 抗氧化復合果蔬酵素多酚和黃酮含量的檢測對比

抗氧化果蔬酵素與原溶液中活性成分含量見圖3。

圖3 抗氧化果蔬酵素與原溶液中活性成分含量Fig.3 The content of active ingredients in Jiaosu and raw solution

酵素中多酚和黃酮含量如圖3 所示，復合抗氧化果蔬酵素中的多酚含量為1.02×103mg/L，原溶液的含量為7.89×102mg/L，發(fā)酵后酵素中的多酚含量提升了29.3%。原溶液的黃酮含量為1.49×102mg/L，復合抗氧化果蔬酵素中的黃酮含量為2.07×102mg/L，較比于原溶液，經(jīng)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后提高了38.9%。黃酮及多酚類化合物是植物中具有抗氧化、抗衰老等諸多生理活性的天然活性物質，其可作為抗氧化劑，提高機體清除自由基，減少組織細胞的氧化損傷；調節(jié)DNA、蛋白質等物質的合成，免受衰老因子的損傷；作為信號因子，調節(jié)基因表達，改善衰老機體代謝情況[6]。因此，酵素中多酚及黃酮類化合物含量的上升，具有清除體內自由基、延緩衰老的潛能。

2.4 抗氧化復合果蔬酵素核黃素含量的檢測對比

抗氧化果蔬酵素核黃素液相色譜圖見圖4。

圖4 抗氧化果蔬酵素核黃素液相色譜圖Fig.4 Rboflavin liquid chromatogram of antioxidant fruit and vegetable Jiaosu

核黃素的液相色譜圖如圖4 所示，其保留時間為25.8 min。對照原溶液中核黃素含量為47.9 mg/L，復合抗氧化果蔬酵素中核黃素含量為51.4 mg/L，發(fā)酵后核黃素含量提高了7.3%。據(jù)研究表明，核黃素為體內黃酶類輔基的組成部分，具有一定的抗氧化活性，當缺乏時會影響機體的生物氧化，使代謝發(fā)生障礙，它的作用機理與黃素酶-谷胱甘肽還原酶有關[16]。

2.5 復合抗氧化果蔬酵素原花青素含量的檢測對比

原花青素的液相色譜圖見圖5。

圖5 抗氧化果蔬酵素原花青素液相色譜圖Fig.5 Procyanidin liquid chromatogram of antioxidant fruit and vegetable Jiaosu

由圖5 可知，其保留時間為6.8 min。復合抗氧化果蔬酵素中原花青素含量為1.98×102mg/L，原溶液中的含量為1.82×102mg/L，原花青素含量相比發(fā)酵前提高了8.8%。原花青素具有極強的抗氧化活性，自由基的清除活性顯著高于維生素C 和維生素E，同時原花青素還具有預防心血管疾病、降“三高”和抗腫瘤的作用。通過鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵，使果蔬中的原花青素充分提取，有助于提高機體的免疫力，減緩人體的衰老[17]。

2.6 復合抗氧化果蔬酵素抗氧化能力的檢測對比

復合抗氧化果蔬酵素抗氧化能力的檢測對比見圖6、圖 7。

圖6 抗氧化果蔬酵素清除率曲線Fig.6 Clearance rate curve of antioxidant fruit and vegetable Jiaosu

圖7 原溶液清除率曲線Fig.7 Clearance rate curve of raw solution

通過DPPH 抗氧化性試驗可得出，復合抗氧化果蔬酵素自由基清除率曲線如圖6 所示，IC50值為0.074；原溶液的自由基清除率曲線如圖7 所示，其IC50值為0.148。通過對比可得抗氧化果蔬酵素的自由基清除率提高了100%，抗氧化能力顯著提高[18]。

3 結論

抗氧化復合果蔬酵素以高生物活性成分的提取為研究目的，研究了酵素發(fā)酵階段菌活、pH 值和總糖的變化特點，得到其發(fā)酵時間為40 h～50 h，并通過與發(fā)酵前原溶液中的生物活性成分以及抗氧化能力的對比發(fā)現(xiàn)，復合果蔬酵素發(fā)酵后的天然活性成分如多酚含量提高了29.3%，黃酮提高了38.9%，核黃素含量提高7.3%，原花青素提高8.8%，抗氧化能力提高了100%。該酵素經(jīng)益生菌轉化后，將原料中的天然抗氧化活性成分完整保留并釋放，并產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物，參與人體新陳代謝并提高機體的抗氧化能力和免疫水平，清除體內過剩自由基，促進細胞增殖，潛在的調節(jié)人體內腸道平衡，促進營養(yǎng)物質的消化和吸收，提高機體免疫力，預防皮膚早衰、延緩衰老等方面具有重要潛能。