滿艷 褚靜

(1棗莊學院校醫(yī)院消化科，山東 棗莊 277160；2棗莊市中醫(yī)醫(yī)院消化科)

結腸癌是我國近年來發(fā)病率升高較快的消化系統(tǒng)腫瘤之一〔1〕。結腸癌患者早期多以納差、體重減輕及排便習慣改變等亞臨床表現(xiàn)為主，大多數(shù)患者就診時已處于疾病中后期而喪失了獲得良好預后的機會〔2〕。因而研究結腸癌新的診斷標志物及分子治療策略對提高結腸癌患者手術切除率及改善患者長期預后具有重要作用。

微小RNA(miRNA)是一類長度在25個堿基以內的單鏈RNA〔3〕。在結腸癌中已發(fā)現(xiàn)許多與細胞增殖〔4〕、轉移〔5〕及血管生成〔6〕密切相關的miRNA。miR-381是近年來新鑒定的出的一種miRNA，它在胃癌〔7〕、肝癌〔8〕及乳腺癌〔9〕中的表達水平顯著下調并能抑制腫瘤細胞生長及侵襲，提示miR-381是一種潛在的抑癌基因。目前，miR-381在結腸癌中的表達變化、臨床意義及生物學功能均尚不完全清楚。本研究通過檢測miR-381在結腸癌中的表達情況；利用人工合成的miR-381模擬物特異性上調結腸癌SW480細胞中miR-381的表達水平，探究上調miR-381基因表達在體外對結腸癌細胞遷移及侵襲能力的影響。旨在為miR-381成為抑制結腸癌轉移的分子治療靶點提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1組織標本 選取2013年1月至2016年10月于棗莊市中醫(yī)醫(yī)院消化科收治并行手術切除的50例結腸癌及對應癌旁組織(距腫瘤邊緣距離>2 cm)標本。所有標本于離體半小時內取材，分兩份于4%多聚甲醛及液氮中固定保存。

1.2細胞來源及主要試劑 SW480細胞由消化科實驗室保存；miR-381模擬物(mimics)、陰性對照模擬物 (control mimics)、miR-381莖環(huán)引物試劑盒(含內參RNU6B)均購自廣州銳博基因公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Trizol RNA提取試劑、Lipofectamine 3000轉染試劑盒、RT-PCR試劑盒及qPCR試劑盒均購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國康寧公司；基質膠購自美國B&D公司；免疫組化Sp法試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司。組蛋白賴氨酸N端甲基轉移酶SET結構域分支型(SETDB)1及GAPDH抗體由Santa Cruz公司提供。SETDB1引物(上游5′-GGGCAAGGGTGTTTTCATTAAC-3′；下游5′-GTTAGTTGATGGCAGGCACACTT-3′)及GAPDH引物(上游5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′；下游5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′)由上海生工生物有限公司合成。

1.3qRT-PCR 通過Trizol試劑提取標本及細胞RNA，配制逆轉錄及PCR擴增體系。設置反轉錄條件：50℃ 30 min，94℃ 2 min，循環(huán)次數(shù)1；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 3 min，循環(huán)次數(shù)40；72℃ 10 min。通過2-△△Ct法檢測miR-381及SETDB1 mRNA的相對含量。

1.4細胞培養(yǎng)及轉染 SW480細胞于適宜環(huán)境中培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代2～3代后進行實驗。將SW480細胞按過夜增殖至愈合度達70%的密度接種6孔細胞培養(yǎng)板。達到預定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液充分洗滌細胞。轉染分組：miR-381組每孔加入100 pmol miR-381 mimics、5 μl Lipofectamine 3000轉染試劑及2 ml無血清DMEM培養(yǎng)基；miR-control組每孔加入100 pmol control mimics、5 μl Lipofectamine 3000轉染試劑及2 ml無血清DMEM培養(yǎng)基。轉染24 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5劃痕愈合試驗 SW480細胞接種于6孔板中，接種密度以過夜鋪滿為準。無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細胞12 h以削弱細胞黏附作用。100 μl的移液器槍頭由每孔中線劃過，PBS清洗6孔板內殘余懸浮細胞，每孔加入2 ml無血清DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照。

1.6Transwell侵襲小室 用1×DMEM按8∶1稀釋50 mg/L的基質膠，按100 μl每孔包被Transwell小室底膜上室面，4℃風干后放入24孔板內。收集轉染后的SW480細胞，以無血清DMEM培養(yǎng)基重懸后調整細胞密度為1×105/ml，按250 μl每孔接種于Transwell小室上室中，24孔板內每孔加入750 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后棄去上室內培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍后采用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，棉棒擦去上室面殘余細胞，在200倍顯微鏡下觀察下室面細胞并計數(shù)。

1.7Western印跡法 RIPA試劑提取細胞總蛋白，電泳、轉膜后用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h；用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋的SETDB1及GAPDH抗體。在4℃下孵育相應條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內，電化學發(fā)光(ECL)法觀察蛋白表達。

1.8免疫組化 多聚甲醛固定、石蠟包埋的結腸癌及癌旁標本組織切片常規(guī)進行脫蠟及水化預處理；用抗體稀釋液按1∶100比例稀釋兔抗人SETDB1多克隆抗體，滴加抗體于組織切片上并充分浸沒組織標本；4℃恒溫冰箱內孵育過夜，洗凈未結合一抗后，使用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗結合相應一抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法顯示陽性蛋白。400倍視野下每張組織切片下隨機選取10個視野按文獻〔10〕所述方法進行免疫組化評分。

1.9統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0進行χ2檢驗及t檢驗。

2 結 果

2.1miR-381在結腸癌組織中的表達及臨床意義 50例結腸癌組織中miR-381的表達水平(0.627±0.054)顯著低于對應癌旁組織(1.361±0.048)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=10.080，P<0.001)。通過分析50例結腸癌患者的臨床病理特征表明，具有淋巴結轉移的結腸癌患者的miR-381表達量(0.457±0.052)比無轉移患者(0.750±0.079)更低(t=2.855，P=0.006)。提示miR-381對腫瘤轉移有一定調節(jié)作用。

2.2miR-381抑制SW480細胞遷移及侵襲 PCR結果顯示，轉染miR-381 mimics的細胞內miR-381表達水平較miR-control組顯著升高(45.378±3.087 vs 1.000±0.000，t=16.564，P<0.001)。劃痕愈合試驗結果表明，與miR-control組比較，miR-381組顯著降低了SW480細胞的遷移能力(73.842±6.793 vs 19.840±5.550，t=4.223，P=0.027)，見圖1；transwell侵襲小室模型檢測結果表明，miR-381組(11.702±4.327)顯著少于miR-control組侵襲細胞數(shù)目(33.103±5.292)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=3.651，P=0.033)，見圖2。

2.3miR-381抑制SW480細胞中SETDB1的表達 為研究miR-381在結腸癌細胞中的作用機制，本研究通過生物信息學檢索發(fā)現(xiàn)SETDB1可能是miR-381的潛在作用靶點之一。見圖3。為驗證這一推測，本研究通過qPCR和蛋白免疫印跡檢測了過表達miR-381后SW480細胞內SETDB1表達的變化。結果表明，與miR-Control組相比，miR-381組SW480細胞內SETDB1 mRNA(1.000±0.000 vs 0.408±0.082，t=10.521，P=0.008)及蛋白(0.881±0.137 vs 0.315±0.056，t=4.786，P=0.027)水平均顯著降低。SETDB1下游靶基因基質金屬蛋白酶(MMP)-2蛋白的表達也明顯下調(0.331±0.034 vs 0.114±0.021，t=3.472，P=0.036)。見圖4、圖5。

2.4SETDB1在肝癌中的表達及與miR-381的表達相關性 結腸癌組織中SETDB1的表達水平較癌旁組織顯著升高(9.064±1.045 vs 3.117±0.521，t=5.272，P=0.011)；Pearson相關性分析表明SETDB1與miR-381的表達呈負相關關系(r=-0.325，P=0.021)。進一步證明了miR-381對SETDB1的調控作用。見圖6、圖7。

圖1 兩組不同時間SW480細胞遷移能力比較(×200)

圖2 兩組SW480細胞侵襲數(shù)目比較(×200)

圖3 miR-381與靶基因SETDB1的互補關系

圖4 Western印跡檢測SETDB1蛋白表達

圖5 Western印跡檢測MMP-2蛋白表達

圖6 SETDB1與miR-381的相關性

圖7 結腸癌組織與癌旁組織SETDB1表達(×400)

3 討 論

miR-381在不同類型的惡性腫瘤中的表達趨勢并不統(tǒng)一〔11〕。本研究通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，miR-381在結腸癌組織中的表達水平要低于癌旁組織，說明在miR-381在結腸癌中可能是一種抑癌因子。同時，有淋巴結轉移的結腸癌組織中miR-381的表達量要更低，因此miR-381可能抑制腫瘤的轉移。為驗證這一假設，本研究設計了一系列體外細胞學實驗證實，miR-381在體外培養(yǎng)環(huán)境中均具有一定的抑制腫瘤細胞侵襲轉移的作用。有研究也指出，miR-381也能夠抑制腫瘤細胞的增殖并促進細胞凋亡而降低腫瘤的生長能力〔12〕。說明miR-381的抗腫瘤效應具有生物多樣性，值得今后的工作中進一步深入研究。

miRNA能夠通過結合靶基因3′-UTR區(qū)而發(fā)揮負向調控作用。通過生物信息學檢索分析發(fā)現(xiàn)，SETDB1 mRNA存在miR-381的結合位點。既往研究〔13〕也表明SETDB1在結腸癌內高表達且具有促癌作用，其可能是miR-381的潛在靶點之一。通過PCR及蛋白印跡試驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR-381在體外的確能下調SETDB1的表達水平。在多種疾病模型中的研究結果表明SETDB1能夠調節(jié)包括Wnt/β-catenin在內的多條信號通路而影響細胞的生物學特性〔14〕。研究表明，與腫瘤細胞侵襲轉移相關的MMP-2也是SETDB1的下游效應分子之一〔15〕。本研究中，過表達miR-381后，在下調SETDB1表達水平的同時MMP-2的表達水平也受到抑制，提示miR-381的抑制腫瘤轉移的作用最終可能是通過下調MMP-2的表達而實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-381在結腸癌中低表達，上調miR-381可能通過抑制SETDB1/MMP-2的表達而抑制結腸癌轉移。