李家睿 閆波

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院心血管內(nèi)科,山東 濟(jì)南 250012;2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

心肌細(xì)胞損傷是心血管系統(tǒng)疾病常見(jiàn)的病理變化〔1〕。目前研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激是引起心肌損傷的重要原因，其可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而導(dǎo)致心肌組織完整結(jié)構(gòu)受到破壞，引起心肌功能損傷〔2〕。LncRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與人類生理和病理功能密切相關(guān)的非編碼RNA，其參與調(diào)控細(xì)胞的分化、凋亡等過(guò)程〔3〕。LncRNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MALAT)1最先在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，參與腫瘤進(jìn)展〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1還參與內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、動(dòng)脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病變等生理和病理過(guò)程〔5～7〕。最近研究顯示，MALAT1在心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)MALAT1能夠抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔8〕。目前對(duì)于MALAT1在氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞凋亡中的作用尚不明確。本研究以過(guò)氧化氫(H2O2)處理心肌細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型，探討MALAT1對(duì)氧化應(yīng)激條件下心肌細(xì)胞凋亡的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；MALAT1 siRNA、siRNA control、miR-200a mimics、mimics control由吉滿生物科技(上海)有限公司合成；熒光素酶報(bào)告載體由南京科佰生物科技有限公司構(gòu)建；miR-200a inhibitor、inhibitor control由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；丙二醛(MDA)含量測(cè)定試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)水平測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2Realtime PCR檢測(cè)H2O2處理后心肌細(xì)胞中MALAT1表達(dá) 心肌細(xì)胞分別用0和100 μmol/L的H2O2處理，分別為Control組和H2O2組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，Realtime PCR測(cè)定MALAT1表達(dá)變化。在細(xì)胞中添加Trizol試劑，提取細(xì)胞總RNA，RNA以RNase-free水溶解，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA OD260/OD280的比值在1.8～2.0。取1 μg RNA模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄步驟同cDNA合成試劑盒，反轉(zhuǎn)錄條件：42℃孵育60 min，72℃孵育10 min，-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)PCR引物進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR，PCR條件：95℃，2 min；95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；共循環(huán)40次。MALAT1正義5′-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3′，反義5′-CCAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3′。GA-PDH正義5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，反義5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取心肌細(xì)胞，放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度生長(zhǎng)到60%時(shí)，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，按照Lipofectamine2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明。將轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA和siRNA control后的心肌細(xì)胞用含有100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為H2O2+si-MALAT1組和H2O2+si-NC組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按照1.2中Realtime PCR方法測(cè)定細(xì)胞中MALAT1表達(dá)變化，評(píng)估下調(diào)效果。

1.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，收集已經(jīng)培養(yǎng)24 h的Control、H2O2、H2O2+si-NC、H2O2+si-MALAT1細(xì)胞，細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，添加提前在4℃預(yù)冷后的磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞懸浮2次，然后添加300 μl結(jié)合緩沖液，依次加入5 μl碘化丙啶(PI)和膜聯(lián)蛋白(Annexin) V-FITC溶液，避光混勻。在上流式細(xì)胞儀檢測(cè)之前添加100 μl結(jié)合緩沖液混勻。

1.5SOD和MDA含量檢測(cè) 收集已經(jīng)培養(yǎng)24 h的Control、H2O2、H2O2+si-NC、H2O2+si-MALAT1細(xì)胞，分別用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中SOD和MDA水平，步驟完全按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程。

1.6靶基因預(yù)測(cè)和熒光素酶系統(tǒng)鑒定 使用生物信息學(xué)軟件(starbase)預(yù)測(cè)MALAT1靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-200a與MALAT1有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。將MALAT1的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)突變，并且構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告載體(MUT)，與miR-200a mimics和mimics control共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，同時(shí)構(gòu)建沒(méi)有突變的野生型熒光素酶報(bào)告載體(WT)與miR-200a mimics和mimics control共轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)2 d后，利用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.7miR-200a inhibitor逆轉(zhuǎn)抑制MALAT1作用 在心肌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA和inhibitor control、MALAT1 siRNA和miR-200a inhibitor，用含有100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為H2O2+si-MALAT1+Anti-NC組、H2O2+si-MALAT1+Anti-miR-200a組。按照上述方法測(cè)定細(xì)胞凋亡和MDA、SOD水平及miR-200a表達(dá)變化，步驟同上。

1.8統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中MALAT1表達(dá)升高 H2O2處理后心肌細(xì)胞中MALAT1水平(1.89±0.13)顯著高于Control組(1.00±0.09，t=9.750，P=0.001)，即H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中MALAT1表達(dá)。

2.2MALAT1 siRNA抑制H2O2條件下心肌細(xì)胞中MALAT1表達(dá) 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA后，H2O2+si-MALAT1組MALAT1表達(dá)水平(0.45±0.06)明顯低于H2O2+si-NC組(1.01±0.12，P<0.05)。

2.3抑制MALAT1減少H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷 經(jīng)過(guò)H2O2處理的心肌細(xì)胞凋亡率升高，MDA含量升高，SOD活性降低。心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA后，經(jīng)過(guò)H2O2處理，細(xì)胞凋亡率降低，MDA含量降低，SOD活性升高，見(jiàn)圖1，表1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定MALAT1 siRNA轉(zhuǎn)染后H2O2處理的心肌細(xì)胞凋亡變化

2.4MALAT1靶向調(diào)控miR-200a 生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)MALAT1與miR-200a有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。構(gòu)建MALAT1-WT和MUT熒光素酶報(bào)告載體，miR-200a mimics和WT共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性降低，見(jiàn)表2。

表1 MALAT1 siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)H2O2處理心肌細(xì)胞凋亡和SOD、MDA的影響

與Control組比較：1)P<0.05；與H2O2+si-NC組比較：2)P<0.05

圖2 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)MALAT1靶向調(diào)控miR-200a

表2 熒光素酶活性變化

2.5抑制MALAT1促進(jìn)H2O2條件下心肌細(xì)胞中miR-200a表達(dá) H2O2處理后心肌細(xì)胞中miR-200a表達(dá)水平(0.63±0.06)顯著低于Control組(1.00±0.10，P<0.05)，MALAT1 siRNA轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)H2O2處理，細(xì)胞中miR-200a水平(0.96±0.11)顯著高于H2O2+si-NC組(0.62±0.05，P<0.05)。

2.6miR-200a inhibitor逆轉(zhuǎn)抑制miR-200a對(duì)H2O2條件下心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷影響 與共轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA和inhibitor control的細(xì)胞比較，在心肌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染MALAT1 siRNA和miR-200a inhibitor，經(jīng)過(guò)H2O2處理，細(xì)胞中miR-200a水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，SOD活性降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 MALAT1 siRNA和miR-200a inhibitor轉(zhuǎn)染后對(duì)H2O2處理心肌細(xì)胞凋亡和SOD、MDA的影響

與H2O2+si-MALAT1+Anti-NC組比較：1)P<0.05

3 討 論

缺血再灌注、心肌缺血、心臟重塑等與心血管系統(tǒng)疾病有關(guān)的心肌損傷過(guò)程中均會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基過(guò)度積累與細(xì)胞中抗氧化酶SOD活性降低有關(guān)，而大量的氧自由基可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔9，10〕。H2O2是常見(jiàn)的體外誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)因子，其能夠促進(jìn)細(xì)胞中脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，生成MDA，造成氧化損傷〔11〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2O2處理后的心肌細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中MDA含量升高，SOD活性降低，說(shuō)明成功構(gòu)建了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型。

MALAT1又稱為NEAT2，其編碼基因定位在11q13.1染色體上，是基因之間的轉(zhuǎn)錄本，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)具有高度保守性，在生物進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔12〕。MALAT1功能十分廣泛，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、表觀遺傳、氧化應(yīng)激等作用〔13〕。以往研究顯示，MALAT1在正常細(xì)胞損傷時(shí)表達(dá)上調(diào)，下調(diào)MALAT1抑制細(xì)胞損傷發(fā)生〔14〕。在心肌細(xì)胞中的研究報(bào)道表明，MALAT1在受到白細(xì)胞介素(IL)-6、LPS等刺激后的細(xì)胞中表達(dá)異常升高，且抑制其表達(dá)能夠明顯下調(diào)心肌細(xì)胞凋亡水平，減少細(xì)胞損傷〔15〕。這些研究結(jié)果可能提示，MALAT1在細(xì)胞損傷過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2O2處理后的心肌細(xì)胞中MALAT1表達(dá)水平升高，抑制MALAT1可以降低H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和MDA合成，提高細(xì)胞中SOD活性，說(shuō)明下調(diào)MALAT1具有保護(hù)心肌細(xì)胞氧化損傷的作用，靶向抑制MALAT1可能是減輕心肌細(xì)胞氧化損傷的途徑。

目前對(duì)于MALAT1的調(diào)控機(jī)制發(fā)現(xiàn)，其可以靶向調(diào)控miRNA的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用，并且其靶基因有多個(gè)，在不同的組織和生理過(guò)程中靶向調(diào)控機(jī)制可能不同〔16〕。目前已知MALAT1靶基因有miR-205、miR-570-3p、miR-23c等〔17～19〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MALAT1與miR-200a有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且miR-200a受到MALAT1的負(fù)調(diào)控作用。以往研究表明，miR-200a在心肌損傷中表達(dá)下調(diào)，且miR-200a能夠緩解心肌損傷程度〔20〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中miR-200a表達(dá)下降，并且下調(diào)miR-200a可以逆轉(zhuǎn)抑制MALAT1對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，說(shuō)明抑制MALAT1通過(guò)靶向上調(diào)miR-200a表達(dá)抑制心肌細(xì)胞氧化損傷。

總之，MALAT1在心肌損傷中可能發(fā)揮促進(jìn)作用，靶向抑制MALAT1表達(dá)通過(guò)上調(diào)miR-200a降低心肌細(xì)胞氧化損傷，減少細(xì)胞凋亡，MALAT1可能是減輕心肌損傷的有效途徑。