王月華 蔣林哲 鞠曉紅 李強(qiáng) 李瑤 鐘秀宏

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院病原技術(shù)教研室，吉林 吉林 132013；2吉林市人民醫(yī)院普通外科；3吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室)

結(jié)腸癌是人類最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年攀升〔1〕，近年來已躍升為我國消化道第二大惡性腫瘤。因結(jié)腸癌缺乏早期特征性表現(xiàn)，常發(fā)展至中晚期才被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致預(yù)后不佳，而早發(fā)現(xiàn)早治療是改善其預(yù)后的重要因素。因此，尋找新的可用于早期診斷和判斷預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物,成為結(jié)腸癌當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。研究表明，人類表皮生長因子受體(HER)2和拓樸異構(gòu)酶(TOPO)Ⅱα擴(kuò)增和過度表達(dá)參與了多種腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)化〔2～5〕。目前國內(nèi)關(guān)于結(jié)腸癌患者HER2和TOPOⅡα研究報(bào)道不盡相同，且多采用免疫組化法檢測，而血清中此兩種蛋白表達(dá)水平研究鮮見報(bào)道。本文旨在探討結(jié)腸癌患者血清HER2和TOPOⅡα含量與結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取吉林市人民醫(yī)院普外科2017年6月至2018 年3月行手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者45例作為結(jié)腸癌組，男26例，女19例，年齡60～75歲，平均(67.13±4.429)歲。正常組織對照取自結(jié)腸外傷手術(shù)組織12例為健康對照組1，男、女各6例，年齡60～69歲，平均(64.42±2.937)歲。正常血清對照為本院體檢中心進(jìn)行體檢的健康人員45例為健康對照組2，男31例，女14例，年齡60～75歲，平均(66.33±4.178)歲。3組性別構(gòu)成、年齡差異不顯著(P>0.05)。

1.2標(biāo)本收集 術(shù)前于清晨空腹，經(jīng)受試者肘靜脈采血3 ml，置于干燥無抗凝劑的試管中。室溫靜置0.5～1.0 h后，3 000 r/min離心5 min，取血清置于EP 管，存放于-80℃冰箱中備用；同時(shí)選取對應(yīng)患者的結(jié)腸癌組織標(biāo)本和健康對照組1組織標(biāo)本，患者術(shù)前未經(jīng)抗腫瘤治療，術(shù)后均經(jīng)病理確診，病例均未同時(shí)患有其他惡性腫瘤，樣本均立即置10%甲醛液內(nèi)固定。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 采用雙抗體夾心法定量檢測血清中HER2和TOPOⅡα的含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自鼎國試劑公司，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，于反應(yīng)結(jié)束后，450 nm波長，空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，得出OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出相應(yīng)的水平值。對結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織分別行MaxVision免疫組織化學(xué)方法定性檢測HER2和TOPOⅡα的表達(dá)。HER2和TOPOⅡα的陽性染色表達(dá)均為大小不一的黃色或棕黃色顆粒，綜合考慮切片中陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞的百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)來判定結(jié)果。根據(jù)染色評分+陽性細(xì)胞比評分=總分?jǐn)?shù),隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野(×400),根據(jù)標(biāo)本顯色程度判斷陽性強(qiáng)度:無色為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分;棕黑色為3分;根據(jù)陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞的比例分為:陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和:<2分為陰性(-)；2～3分為弱陽性(+)；4～5分為中度陽性()；6～7分為強(qiáng)陽性()。

1.4數(shù)據(jù)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)和Spearman等級相關(guān)分析法應(yīng)用于相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1HER2和TOPOⅡα在結(jié)腸癌組和健康對照組1組織中的表達(dá) 結(jié)腸癌組HER2主要表達(dá)于細(xì)胞膜，而TOPOⅡα主要見于細(xì)胞核。見圖1。結(jié)腸癌組HER2和TOPOⅡα陽性表達(dá)率分別為〔17例(37.8%)〕和〔26例(57.8%)〕；健康對照組1未見HER2和TOPOⅡα表達(dá)。 結(jié)腸癌組HER2和TOPOⅡα表達(dá)陽性率明顯高于健康對照組1(P<0.05)。

圖1 結(jié)腸癌組組織中HER2和TOPOⅡα表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

2.2兩組HER2和TOPOⅡα血清表達(dá) 結(jié)腸癌組血清HER2和TOPOⅡα水平均明顯高于健康對照組2(P<0.05)，見表1。

表1 兩組HER2和TOPOⅡα血清中表達(dá)

與結(jié)腸癌組比較：1)P<0.05

2.3HER2和TOPOⅡα在癌組織表達(dá)相關(guān)性 結(jié)腸癌組織中26例TOPOⅡα表達(dá)陽性中有15例HER2表達(dá)陽性；19 例TOPOⅡα表達(dá)陰性的結(jié)腸癌組織中17例HER2亦表達(dá)陰性；HER2和TOPOⅡα表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.480,P<0.05)。

2.4HER2和TOPOⅡα在結(jié)腸癌血清中表達(dá)相關(guān)性 結(jié)腸癌組血清中HER2和TOPOⅡα表達(dá)正相關(guān)(r=0.610,P<0.05)。

3 討 論

HER2蛋白是原癌基因HER2/neu(17q12-21)〔6〕編碼的具有受體酪氨酸激酶活性的185 kD跨膜糖蛋白，屬于表皮生長因子受體家族的一員。HER2由胞外氨基末端配體結(jié)合域、單鏈跨膜區(qū)域及具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域構(gòu)成，存在于細(xì)胞表面的胞外段受蛋白酶裂解脫落釋放進(jìn)入血液即血清HER2(sp185)蛋白。本研究結(jié)果提示：HER2參與了結(jié)腸癌的發(fā)生，且在組織和血清中均高表達(dá)。HER2主要表達(dá)于胚胎時(shí)期，成年后一般只出現(xiàn)在少數(shù)正常組織中。當(dāng)HER2表達(dá)上調(diào)，可被相應(yīng)的配體激活影響下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如通過蛋白激酶(Akt)通路抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活；通過Ras/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化〔7〕。故出現(xiàn)擴(kuò)增和過表達(dá)，可能提示腫瘤的發(fā)生〔8〕。

TopoⅡα是真核細(xì)胞內(nèi)的一種重要核酶，是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的一種〔9〕。因其能夠催化DNA鏈的斷裂與結(jié)合，調(diào)控DNA的拓?fù)錉顟B(tài)，參與基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程中DNA 空間結(jié)構(gòu)和生理功能調(diào)節(jié)，故與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示，TopoⅡα可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生，且在組織和血清中均高表達(dá)。TopoⅡα通過催化切斷DNA鏈的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生DNA缺口而發(fā)揮作用，這種缺口可以改變DNA分子的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而解決DNA纏結(jié)狀態(tài)這一問題。TopoⅡα表達(dá)降低，將阻止DNA快速修復(fù)，斷裂的DNA雙鏈積累將激活DNA損傷反應(yīng)，導(dǎo)致G1、S和(或)G2阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔10〕。研究顯示TopoⅡα多表達(dá)于增殖細(xì)胞內(nèi)，而且在快速增殖細(xì)胞中的表達(dá)水平是靜止細(xì)胞的數(shù)倍，主要表達(dá)于S 期、G2期及 M 期細(xì)胞，高表達(dá)時(shí)提示腫瘤復(fù)制加快,增加腫瘤的惡性程度〔6〕。故TopoⅡα過表達(dá)可能提示腫瘤的發(fā)生〔11〕。

本研究顯示，HER2和TopoⅡα在結(jié)腸癌組織和血清中表達(dá)呈正相關(guān)。由于HER2基因與TopoⅡα基因均定位于17q12～q21染色體上，所以兩種基因的擴(kuò)增或缺失可能具有協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)HER2表達(dá)增高，可激活PI3K和Ras/MAPK等信號通路，調(diào)節(jié)下游靶基因，間接促進(jìn)TopoⅡα表達(dá)上調(diào)，這在分子水平上為二者在結(jié)腸癌中表達(dá)相關(guān)性提供了一定的理論依據(jù)。血清檢測是一個(gè)非侵入性并可量化的檢測方式，利于早期篩查，故聯(lián)合檢測二者在結(jié)腸癌組織和血清中的表達(dá)，為了解HER2和TopoⅡα與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)〔12〕。為確保HER2和TOPOⅡα作為結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物的可靠性，還需要進(jìn)行更多樣本的研究，以確立二者對結(jié)腸癌的診斷價(jià)值。