劉春都,朱葉飛

(1.南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗中心，南京 210011； 2.南京市浦口醫(yī)院檢驗科，南京 210031)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)廣泛分布于自然界，為條件致病菌，是醫(yī)院及社區(qū)感染中較常見的病原菌，可引起多種感染性疾病，尤其是在免疫功能低下或缺陷的患者中感染更為常見，甚至還危及生命[1]。近年來，由于各種器械性和侵入性治療手段，以及抗菌藥物的廣泛使用，其耐藥率不斷上升。2017年中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)顯示，PA的分離率在革蘭陰性菌中為第4位，在非發(fā)酵菌中為第2位，對抗生素的耐藥率不斷升高[2]。PA的耐藥性愈加嚴重，引起PA的耐藥機制也非常復雜，其中PA生物膜的形成是PA產(chǎn)生耐藥的重要機制。據(jù)報道，醫(yī)院獲得性感染中30%是由PA引起，并且它極易形成生物膜，易對患者造成慢性持續(xù)性感染[3]。研究表明，65%～80%的人類細菌感染與生物膜有關(guān)，細菌的生物膜態(tài)對抗菌藥物的耐藥性顯著高于浮游態(tài)[4]。本研究通過建立體外PA生物膜模型,比較生物膜態(tài)與游離態(tài)PA對抗菌藥物的耐藥性，為臨床上預防和治療生物膜感染提供思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集2017年1—12 月南京市浦口醫(yī)院細菌室分離、鑒定的63株P(guān)A，所有菌株均按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版[5]的要求，分離、培養(yǎng)并經(jīng)VITEK-60 微生物儀鑒定。去除相同部位的重復菌株?？剖曳植迹褐匕Y監(jiān)護病房30株，腫瘤科11株，呼吸內(nèi)科9株，老年科6株，消化內(nèi)科3株，血液科2株，內(nèi)分泌科2株；標本來源：痰液34株，尿液10株、血液6株、膿液4株、分泌物4株、導管3株及膽汁2株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，購自國家衛(wèi)生健康委員會臨床檢驗中心。

1.1.2培養(yǎng)基 溶菌肉湯、水解酪蛋白培養(yǎng)基均購自法國梅里埃公司生產(chǎn)。

1.1.3試劑與儀器 0.1%結(jié)晶紫溶液、95%乙醇、磷酸鹽緩沖液、藥敏試劑和藥敏紙片(購自法國梅里埃公司)、96孔平板，SpectramaxM3酶標儀、漩渦混合器、VITEK-60微生物鑒定系統(tǒng)(購自法國梅里埃公司)。

1.2方法

1.2.1PA復溶、增菌 將臨床分離的PA從低溫冰箱中取出解凍并接種于血平板，37 ℃過夜，挑取單個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 18～24 h培養(yǎng)增菌。

1.2.2PA生物膜體外構(gòu)建 用標準比濁儀將增菌培養(yǎng)的PA調(diào)節(jié)成0.5麥氏單位濃度，取10 μL加入96孔板中(每孔含1∶50稀釋的LB培養(yǎng)液200 μL)。每株菌做3個復孔，3個空白孔(不加菌液)，37 ℃培養(yǎng)72 h，每24小時更換溶菌肉湯培養(yǎng)液一次。

1.2.3結(jié)晶紫染色 細菌培養(yǎng)72 h后，在每個平板孔中加入150 μL 0.1%的結(jié)晶紫染液染色15 min，用緩沖液沖洗3次后晾干，每孔再加入95%乙醇150 μL脫色2 min[6]。

1.2.4生物膜定量檢測及判斷標準 用酶標儀測定每株菌的復孔OD570，對照管吸光度(comparison optical density,ODC)定義為空白對照孔的平均OD，加上標準差s,即ODC=OD空白+1s[7-8]。當待測菌OD值(OD測)≤ODC時，則無生物膜形成；當OD測>ODC時，則此菌株有生物膜形成。

1.2.5紙片擴散法藥敏試驗 按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版[5]的要求，用紙片擴散法進行PA浮游態(tài)及生物膜態(tài)的藥敏試驗，藥敏結(jié)果依照2010年美國臨床實驗室標準化協(xié)會規(guī)定的標準判斷耐藥情況[9]。

1.2.6PA浮游菌最小抑菌濃度和PA生物膜菌最小生物膜清除濃度的測定 將臨床常用的阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、氨曲南、環(huán)丙沙星12種抗菌藥物分別在96孔板上采用微量稀釋法測定浮游菌的最小抑菌濃度(即能抑制PA生長的最小藥物濃度)：對形成生物膜的PA，在去除浮游菌后，在超聲波震蕩作用下，混勻器充分混勻后，微量稀釋法測定最小生物膜清除濃度(即能清除PA生物膜的最小抗菌藥物濃度)。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1生物膜形成定量測定 將臨床分離、培養(yǎng)、鑒定、收集的63株P(guān)A菌株經(jīng)過96孔微量平板72 h培養(yǎng)，結(jié)晶紫染色法定量檢測每株菌的OD值，結(jié)果有1株菌的ODODC形成生物膜，占98.4%。

2.2浮游態(tài)與生物膜態(tài)PA的耐藥率 生物膜態(tài)阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、氨曲南、環(huán)丙沙星的PA耐藥率均高于浮游態(tài)(P<0.01)，浮游態(tài)PA耐藥率最低的是阿米卡星和哌拉西林/他唑巴坦，而生物膜態(tài)PA耐藥率最低的是阿米卡星，其他均高于50%，其中最高的兩種分別是對氨曲南和替卡西林/克拉維酸。見表1。

表1 浮游態(tài)與生物膜態(tài)PA藥敏試驗耐藥率比較 [株數(shù)(%)]

PA：銅綠假單胞菌

2.3PA對抗菌藥物的最小抑菌濃度、最小生物膜清除濃度的值 生物膜態(tài)PA的最小生物膜清除濃度值與相應的浮游態(tài)PA的最小抑菌濃度值相比明顯增大，氨曲南、亞胺培南和替卡西林、克拉維酸的最小生物膜清除濃度值均超過檢出限，生物膜菌最小生物膜清除濃度是浮游菌的10倍以上。見表2。

表2 PA浮游態(tài)最小抑菌濃度值與生物膜態(tài)最小生物膜清除濃度值 (n=62,μg/mL)

PA：銅綠假單胞菌

3 討 論

細菌的生物膜指細菌黏附于機體腔道或物體的表面時分泌的含有多種蛋白多糖的復合物,以藻酸鹽為主要成分的胞外多糖基質(zhì)[10-11]，細菌分泌的胞外基質(zhì)可將這些細菌粘連在一起形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的單種或多種細菌群體。生物膜的形成是一個動態(tài)過程，受到細菌密度感應系統(tǒng)的調(diào)控。密度感應系統(tǒng)是指在形成生物膜的過程中，細菌分泌一些分子物質(zhì)到細胞外基質(zhì)中，當達一定程度時就可激發(fā)一定的基因表達，這種情況就稱為密度感應系統(tǒng)。PA有Las和Rhl兩個密度感應系統(tǒng),其中Las系統(tǒng)由LasR和LasI兩個基因組成，Rhl系統(tǒng)由RhlR及RhlI基因組成[12-14]。細菌的密度感應系統(tǒng)與生物膜的形成密切相關(guān)，是生物膜形成過程中必不可少的。任何阻斷密度感應系統(tǒng)的方法都可以阻止細菌生物膜的形成，這為治療生物膜態(tài)PA感染提供了一個新的有效方法。

本研究結(jié)果顯示，生物膜態(tài)阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、氨曲南、環(huán)丙沙星的PA耐藥率均高于浮游態(tài)(P<0.01)，說明患者感染PA后一些臨床常規(guī)的抗菌藥物對PA有一定的殺傷作用，患者感染PA的癥狀有所好轉(zhuǎn)，但隨著患者住院時間增加以及有些患者各種導管、支架、留置針等的使用，PA菌株就黏附在這些物體表面或患者本身的腔道表面，經(jīng)過反復的可逆黏附，PA菌株也不斷增加，接著進入到不可逆黏附階段，PA菌株在附著部位越積越多，分泌的胞外基質(zhì)物質(zhì)也越來越多，聚集的這些物質(zhì)除細菌本身外，還含有水、細菌的代謝產(chǎn)物以及細菌變性、壞死、裂解的產(chǎn)物等，在多種因子的共同作用下，最后形成PA的生物膜。開始形成的生物膜在密度感應系統(tǒng)的作用下，膜中的細菌越來越緊密，膜本身也更加致密，最后形成成熟、穩(wěn)固、具有一定三維結(jié)構(gòu)的PA生物膜，這是一個動態(tài)過程[15-17]。

形成膜后的PA與浮游態(tài)的PA理化特點、生物學特征、基因構(gòu)型均有所不同(浮游態(tài)PA與生物膜態(tài)PA至少有45個基因不同)，致病性也不同[18-19]。本研究耐藥性試驗結(jié)果顯示，細菌形成生物膜后耐藥性顯著提高。與浮游菌相比，生物膜菌的耐藥性大大提高，易引起難治性感染。常用的一些常規(guī)劑量的抗菌藥物不僅不能起到抗菌殺菌的作用，反而易引起耐藥性增加，給治療帶來極大的挑戰(zhàn)。加強細菌耐藥性的研究，特別是容易形成生物膜的PA的耐藥性研究具有現(xiàn)實意義[11]。

本研究結(jié)果還顯示，生物膜態(tài)PA的最小生物膜清除濃度值與相應的浮游態(tài)PA的最小抑菌濃度值相比明顯增大，并且氨曲南、亞胺培南和替卡西林、克拉維酸的最小生物膜清除濃度值均超過檢出限?？梢奝A形成生物膜后，其耐藥性明顯提高，說明生物膜形成是PA極易產(chǎn)生耐藥的重要原因。生物膜產(chǎn)生耐藥的機制非常復雜，主要體現(xiàn)為以下幾點。①生物膜的阻擋作用：PA生物膜是以藻酸鹽為主要成分的多糖基質(zhì)，是具有空間結(jié)構(gòu)的聚集物，是細菌抵抗外界環(huán)境的天然屏障，也可以阻擋各種抗菌藥物進入細菌從而起到耐藥作用。有學者通過光譜分析，觀察到環(huán)丙沙星滲透進細菌生物膜的速度比滲透進相應浮游菌的速度降低顯著[2]。但機械性的阻擋作用顯然不是細菌生物膜耐藥性升高的主要原因。有文獻報道，氨芐青霉素可穿透有β-內(nèi)酰胺酶突變體的肺炎克雷伯菌的生物膜，但此菌仍對氨芐青霉素耐藥[20]。②生物膜基因表型的作用：細菌形成生物膜后，為了適應周圍的環(huán)境，其生物學特性發(fā)生變化，形成了生物膜表型，原來抗菌藥物的靶細胞結(jié)合的靶位改變，使得抗菌藥物不能與它結(jié)合，導致細耐藥性產(chǎn)生。③生物膜外排泵的作用：外排泵是位于膜上的一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，它可以將進入細胞內(nèi)的抗菌藥物排出胞外，導致細菌的耐藥性產(chǎn)生。PA對第一代頭孢菌素、第二代頭孢菌素、頭孢曲松、氨芐西林等藥物天然耐藥，主要機制是這些藥物作用于PA時，使膜上的外排泵過度表達，藥物排出增多，進入菌體內(nèi)的藥物不能達到有效濃度，導致耐藥性產(chǎn)生。④密度感應系統(tǒng)的作用：密度感應系統(tǒng)在生物膜的整個形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，保證生物膜的形成與降解平衡，保持整個動態(tài)過程有序進行。一旦密度感應系統(tǒng)遭到破壞，生物膜的形成就會受到嚴重影響，該菌的生物學特性發(fā)生改變，耐藥性也會變化。⑤氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的變化：細菌一旦形成了生物膜，生物膜就將它緊緊裹住，生物膜的致密結(jié)構(gòu)阻礙了細胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，細菌的代謝產(chǎn)物不能排出去，而細菌生長需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)也不能轉(zhuǎn)運進來，PA為了適應環(huán)境生存下來，這些生物膜態(tài)的生物學性狀就會發(fā)生改變，因此這些PA的耐藥性也會變化。此外，膜上的位點、靶位、通道及酶發(fā)生改變對PA的耐藥性都有直接影響。隨著對細菌生物膜的深入研究還會有新的機制提出。同時生物膜對任何一種藥物的耐藥均是多種機制綜合作用的結(jié)果[21]。

綜上所述，由于生物膜PA對臨床常規(guī)抗菌藥物的耐藥性嚴重，在臨床上應盡量避免生物膜的形成，防止細菌生物膜的感染。對于使用器械性材料的病患應該使用敏感的抗菌材料，抑制相應的細菌黏附和生長，阻止生物膜的形成，此外抑制細菌群體感應系統(tǒng)，聯(lián)合用藥為當前治療生物膜感染的重要方法，同時中草藥、物理、生物等方法也可用于臨床，防止生物膜形成[22]。