郭生龍，李鵬，雷琦

（陜西省人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710068）

腦梗死是臨床常見(jiàn)的腦血管疾病，是由多種原因?qū)е碌木植磕X組織區(qū)域發(fā)生血液供應(yīng)障礙，引起腦組織缺血、缺氧性病變，從而產(chǎn)生的一系列臨床癥狀，是一種具有極高病死率和致殘率的疾病[1]。動(dòng)脈硬化被認(rèn)為是導(dǎo)致腦梗死的重要因素之一，而甘油三酯（Triglycerides,TG）的升高已經(jīng)證實(shí)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。隨著研究進(jìn)一步深入，載脂蛋白A5（ApoA5）與動(dòng)脈硬化被認(rèn)為具有一定的關(guān)系，本研究觀察陜西省人民醫(yī)院腦梗死患者的動(dòng)脈粥樣硬化程度和ApoA5-1131T/C、553G/T 2 個(gè)位點(diǎn)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般研究

隨機(jī)選取2015年1月—2017年1月陜西省人民醫(yī)院腦梗死患者120 例進(jìn)行臨床研究。所有患者符合全國(guó)第4 屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭CT 和頸部超聲確定診斷。其中，男性77 例，女性43 例；年齡58～79 歲，平均（72.33±5.14）歲。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：①病程為72 h 內(nèi)；②病變部位僅限于頸內(nèi)動(dòng)脈供血區(qū)域；③既往無(wú)中風(fēng)病史；④患者或者患者家屬對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)[4]：①合并其 他系統(tǒng)、器官、部位炎癥病變的患者；②既往有腦出血或者腦梗死病史的患者；③合并冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心房顫動(dòng)、心肌梗死、肝腎衰竭的患者；④合并大動(dòng)脈炎等動(dòng)脈系統(tǒng)疾病的患者；⑤來(lái)診前1個(gè)月內(nèi)有炎癥抑制藥物或者免疫抑制劑應(yīng)用史患者；⑥有自身免疫系統(tǒng)疾病病史的患者。

1.3 研究方法

1.3.1 頸動(dòng)脈超聲檢查 所有患者給予頸動(dòng)脈血管超聲檢查?；颊呷⊙雠P位、頸部充分暴露，常規(guī)檢查患者的雙側(cè)頸總動(dòng)脈、頸動(dòng)脈分叉部、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。掃查血管壁、血管斑塊形成的數(shù)量、大小、性質(zhì)、血管狹窄程度。測(cè)量頸總動(dòng)脈內(nèi)膜-中層厚度（common carotid artery intima-media thickness,CCA-IMT）和 頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度（internal carotid artery intimamedia thickness,ICA-IMT）。

1.3.2 基因DNA 提取 使用EDTA-K2 抗凝試管取患者靜脈血1 ml，提取基因組DNA，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP） Trizol 購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL 公司，Taq酶購(gòu)自大連寶生物公司，模板RNA 2 μg、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Promega 公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，UVIpro 凝膠圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)KODAK 公司。將標(biāo)本通過(guò)Trizol 方法提取組織總RNA。PCR 反應(yīng)條件：①-1131T/C 位點(diǎn)，96℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)30 次，72℃繼續(xù)延伸5 min。②553G/T 位點(diǎn)，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火40 s，72℃延伸50 s，共循環(huán)35 個(gè)，72℃繼續(xù)延伸7 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10LL 在-1131T/C 位點(diǎn)加入限制性內(nèi)切酶MseI 5 u，553G/T 位點(diǎn)加入MspI 5 u，37℃消化4 h。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min，使用UVIpro 凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像、掃描、分析。

1.3.4 血脂相關(guān)指標(biāo)檢查 取患者清晨空腹靜脈血3 ml，檢測(cè)其TG、低密度脂蛋 白（low-density lipoprotein,LDL）、 高密度脂蛋白（high-density lipoprotein,HDL）、血清總膽固醇（total cholesterol,TC）水平。上述所有指標(biāo)由本院生化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，儀器為7060 全自動(dòng)血生化儀（日本日立公司），嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

1.4 分析指標(biāo)

觀察-1131T/C 位點(diǎn)和553G/T 位點(diǎn)間的CCA-IMT和ICA-IMT 間的差異，觀察-1131T/C 位點(diǎn)和553G/T 位點(diǎn)不同基因型的TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。比較常見(jiàn)單倍型配對(duì)間的CCA-IMT 和ICA-IMT 水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 -1131T/C 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較

-1131T/C 位點(diǎn)基因型為CC 的患者與基因型為TT+TC 的患者CCA-IMT 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；-1131T/C 位點(diǎn)基因型為CC 的患者與基因型為TT+TC 的患者ICA-IMT 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），CC 基因型的ICA-IMT 高于TT+TC 基因型。見(jiàn)表1。

2.2 553G/T 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較

553G/T 位點(diǎn)基因型為GG 與TT+GT 基因型的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見(jiàn)表2。

表1 -1131T/C 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較（mm，±s）

表1 -1131T/C 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較（mm，±s）

基因型 n CCA-IMT ICA-IMT CC 13 1.10±0.27 1.06±0.13 TT+TC 107 1.06±0.33 0.91±0.14 t 值 0.420 3.678 P 值 0.675 0.000

表2 553G/T 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較（mm，±s）

表2 553G/T 基因型腦梗死患者的CCA-IMT 和ICA-IMT 比較（mm，±s）

基因型 n CCA-IMT ICA-IMT GG 102 1.09±0.22 0.95±0.14 TT+GT 18 1.12±0.27 1.01±0.18 t 值 0.515 1.603 P 值 0.608 0.112

2.3 -1131T/C 位點(diǎn)不同基因型患者的血脂水平比較

-1131T/C位點(diǎn)基因型CC與TT+TC位點(diǎn)患者TC、HDL-C、LDL-C 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），-1131T/C 位點(diǎn)基因型CC 與TT+TC 位點(diǎn)TG 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CC 位點(diǎn)TG水平高于TT+TC 水平。見(jiàn)表3。

2.4 553G/T 位點(diǎn)不同基因型患者的血脂水平比較

553G/T 位點(diǎn)基因型GG 與TT+GT 位點(diǎn)患者TC、TG、HDL-C 及LDL-C 水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 常見(jiàn)單倍型配對(duì)間的CCA-IMT 和ICA-IMT水平比較

TG-TG、TG-CG、TG-CT、CG-CG 的CCA-IMT水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而ICA-IMT水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中CG-CG型最高，TG-CG 型最低。見(jiàn)表5。

表3 -1131T/C 位點(diǎn)不同基因型患者的血脂水平比較（mmol/L，±s）

表3 -1131T/C 位點(diǎn)不同基因型患者的血脂水平比較（mmol/L，±s）

基因型 n TC TG HDL-C LDL-C CC 13 4.15±0.22 2.20±0.19 1.07±0.18 2.25±0.15 TT+TC 107 4.20±0.18 1.77±0.23 1.04±0.13 2.27±0.12 t 值 0.923 6.471 0.751 0.552 P 值 0.358 0.000 0.454 0.582

表4 553G/T 位點(diǎn)不同基因型患者的血脂水平比較（mmol/L，±s）

表4 553G/T 位點(diǎn)不同基因型患者的血脂水平比較（mmol/L，±s）

基因型 n TC TG HDL-C LDL-C GG 102 4.13±0.15 1.71±0.25 1.15±0.06 2.47±0.18 TT+GT 18 4.20±0.20 1.59±0.62 1.12±0.12 2.42±0.16 t 值 1.731 1.432 1.634 1.103 P 值 0.086 0.158 0.105 0.272

表5 常見(jiàn)單倍型配對(duì)間的CCA-IMT 和ICA-IMT 水平比較（mm，±s）

表5 常見(jiàn)單倍型配對(duì)間的CCA-IMT 和ICA-IMT 水平比較（mm，±s）

單倍型配對(duì) n CCA-IMT ICA-IMT TG-TG 52 1.03±0.18 0.99±0.13 TG-CG 41 1.02±0.04 0.96±0.18 TG-CT 10 1.04±0.10 1.07±0.10 CG-CG 17 1.08±0.08 1.14±0.06 F 值 1.106 3.447 P 值 0.092 0.018

3 討論

載脂蛋白是血漿脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，其作用是遇血脂結(jié)合并運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體各個(gè)組織中進(jìn)行代謝，以及進(jìn)行蛋白質(zhì)利用[5]。大量研究發(fā)現(xiàn)載脂蛋白基因發(fā)生突變，形成不同等位基因多態(tài)性，而不同表型的載脂蛋白對(duì)血脂的代謝和利用會(huì)發(fā)生不同影響，進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響，對(duì)患者高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管等疾病的發(fā)生和發(fā)展起到一定作用。目前研究認(rèn)為，載脂蛋白具有促進(jìn)脂類運(yùn)輸、調(diào)節(jié)酶活性、同細(xì)胞表面結(jié)合等作用，是一組在功能上非?；钴S的血漿蛋白[6-7]。

載脂蛋白主要分為A、B、C、D、E 5 個(gè)種類，在肝臟和小腸中合成。其中載脂蛋白在分子量、免疫性和代謝上均呈現(xiàn)出多態(tài)性，在HDL 中含量最多，是構(gòu)成血漿HDL 的重要組成部分，具有清除組織脂質(zhì)和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[8-9]。

ApoA5 是載脂蛋白超家族的新成員，是在2001年由2 個(gè)不同的研究小組先后于載脂蛋白A1、載脂蛋白C3、載脂蛋白A4 的基因簇中所鑒定出來(lái)，而且研究發(fā)現(xiàn)人類的載脂蛋白A5 的基因與小鼠的載脂蛋白A5 基因的同源性能夠達(dá)到71%，但是與人類載脂蛋白A4 的基因同源性僅為27%[10]。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)，盡管其濃度較低，但是對(duì)降低血漿TG 具有重要意義，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)與肥胖和代謝綜合征的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系[11]。人類的ApoA5 是由343 個(gè)氨基酸殘基所組成，結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)雙性的A-螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)也包含有B 折疊和B 轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[12]。A-螺旋結(jié)構(gòu)是ApoA5 的活性中心，在疏水性和長(zhǎng)度上出現(xiàn)非常大的差異性，使用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)ApoA5 在極LDL、HDL、乳糜微粒中均有存在，因此被認(rèn)為在調(diào)節(jié)富含TG 脂蛋白代謝過(guò)程中具有重要作用，并認(rèn)為可能存在一個(gè)機(jī)制，使其循環(huán)再利用，從而彌補(bǔ)ApoA5 在外周循環(huán)中出現(xiàn)的含量不足的問(wèn)題[13]。

-1131T/C 位點(diǎn)和553G/T 位點(diǎn)被認(rèn)識(shí)是影響ICA- IMT 厚度變化的基因型，這一機(jī)制可能與-1131CC 基因型具有誘導(dǎo)頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)膜變厚的作用，553GG 基因?qū)CA-IMT 具有一定影響，這一機(jī)制可能與患者基因表達(dá)蛋白質(zhì)不同有所關(guān)聯(lián)。-1131CC 基因型所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有血脂在頸內(nèi)動(dòng)脈的內(nèi)膜中沉積的作用，而553TT+GT 基因型所表達(dá)出的蛋白具有促進(jìn)血脂在頸總動(dòng)脈沉積的作用[14-15]。如果能確定不同基因在人體血脂沉積過(guò)程中起到的作用，也就為動(dòng)脈粥樣硬化的基因治療提供了新的思路。

從本研究來(lái)看，-1131T/C 位點(diǎn)基因型中CC 與TT+TC 基因型的CCA-IMT 無(wú)差異，-1131T/C 位點(diǎn)基因型中CC 與TT+TC 基因型的ICA-IMT 有差異，CC的ICA-IMT 高于TT+TC，說(shuō)明-1131CC 具有促使ICA-IMT 增厚的作用，該作用可能通過(guò)誘導(dǎo)血脂在頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)膜中沉積的作用。而553G/T 位點(diǎn)基因型中GG 與TT+GT 基因型的CCA-IMT 與ICA-IMT 無(wú)差異，說(shuō)明553G/T 位點(diǎn)基因型對(duì)CCA-IMT、ICA-IMT 的厚度增加并無(wú)明顯作用。-1131T/C 位點(diǎn)基因型CC 與TT+TC 位點(diǎn)TC、HDL-C、LDL-C 水平無(wú)差異，但CC位點(diǎn)TG 水平高于TT+TC 水平有差異，說(shuō)明-1131T/C 位點(diǎn)基因型CC 對(duì)TC、HDL-C、LDL-C 水平無(wú)影響，但能夠影響TG 水平的升高，這也與-1131CC 具有促使ICA-IMT 增厚的作用相符合。而553G/T 位點(diǎn)基因型GG 與TT+GT 位點(diǎn)患者TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平無(wú)差異，說(shuō)明553G/T 位點(diǎn)基因型未改變CCA-IMT、ICA-IMT 的厚度的作用。在常見(jiàn)單倍型配對(duì)間的CCAIMT 和ICA-IMT 水平影響中，TG-TG、TG-CG、TGCT、CG-CG 的CCA-IMT 無(wú)差異，而ICA-IMT 水平有差異，其中CG-CG 型最高，TG-CG 型最低。說(shuō)明不同的單倍型配對(duì)會(huì)影響ICA-IMT 厚度，這也成為促使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的重要因素。

綜上所述，載脂蛋白A5 基因-1131T/C 和553G/T 兩個(gè)位點(diǎn)與腦梗死患者的動(dòng)脈硬化程度聯(lián)系緊密，能夠促使血脂在頸動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈中發(fā)生沉積，從而誘導(dǎo)動(dòng)脈硬化發(fā)生、發(fā)展，因此對(duì)基因的研究有可能為動(dòng)脈硬化的預(yù)防與治療提供新的思路，值得進(jìn)一步深入研究，而ApoA5 作為新發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白超家族的成員，仍然有大量的研究工作需要進(jìn)行，以便觀察其在腦梗死患者動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。