張騰，馮浩，蔣甜甜，張源

（1.長沙市中醫(yī)醫(yī)院 皮膚科，湖南 長沙 410199；2.湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，湖南 長沙 410005）

近年來自體脂肪移植已廣泛用于臨床，因其移植后過高的吸收率，限制其臨床應(yīng)用，如何提高脂肪移植后成活率成為了目前研究的熱點[1-2]；目前臨床公認，按Coleman 離心方法[3]提純脂肪可最大限度提高其成活率，本研究進一步探究按Coleman 離心方法提純后不同層次脂肪的成活率，以便進一步指導(dǎo)臨床，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

伊紅及蘇木精（美國Sigma 公司），CD31 抗體（英國Abcam 公司），青-鏈霉素（美國Hyclone 公司），超凈工作臺（上海索普儀器公司），熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），恒溫水浴箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），電子天平（德國Sartorius 公司），外科手術(shù)器械及外科手術(shù)臺（西安寶生手術(shù)器材有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物 3月齡新西蘭兔12 只、雌雄不限，體重2 500～3 000 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

1.2.2 模型復(fù)制及分組 復(fù)制新西蘭兔自體脂肪移植模型（12 只）：獲取新西蘭兔腹股溝皮下脂肪并移植于該兔背部皮下。依次將新西蘭兔固定于手術(shù)臺，背部及腹股溝備皮、消毒、用耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉；待麻醉生效后，將新西蘭兔腹股溝皮膚剪開，分離出腹股溝脂肪，并于超凈臺下剪碎，剔除筋膜，然后按照Coleman 離心方法[3]提純脂肪，脂肪離心后去掉上層油脂及下層細胞及筋膜殘渣，最后將剩余的脂肪組織分為上、中、下3組；每組取1 ml 脂肪組織；依次注射于兔背部皮下；待新西蘭兔蘇醒后放回飼養(yǎng)籠。

1.2.3 計算脂肪移植后成活體積 分別于脂肪移植術(shù)后3 個月麻醉處死新西蘭兔，剝離背部脂肪移植物，用排水法測量其體積。

1.2.4 HE 染色觀察脂肪移植物成活質(zhì)量 將所取脂肪移植物迅速置于10%甲醛中固定。24 h 常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色。在10 倍鏡下觀察脂肪組織的囊泡、纖維化程度及其完整脂肪細胞。評價方法包含3 個參數(shù)：脂肪組織中囊泡數(shù)目、纖維化程度、完整脂肪細胞數(shù)目；每個參數(shù)分為0～6 6 個分值：0=無、1=少量、2=比中量少、3=中量、4=比中量多、5=大量。所有組織學(xué)評價均由經(jīng)過培訓(xùn)的實驗人員完成。

1.2.5 CD31 染色觀察脂肪移植物血管密度 石蠟包埋移植脂肪組織，切片機切成約5 μm 厚度的組織白片用于CD31 免疫組織化學(xué)染色。經(jīng)過65℃烘烤、脫蠟、水化后微波抗原修復(fù)，3%過氧化氫去內(nèi)源性過氧化物酶，一抗為鼠源Anti-CD31 抗體（1 ∶100 稀釋），于4℃孵育過夜后行DAB 染色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。在脂肪細胞周圍的間質(zhì)中，血管內(nèi)皮細胞被標(biāo)記為深棕色，并構(gòu)建成官腔樣結(jié)構(gòu)。采用Image-Pro Plus 6 計數(shù)血管密度（條）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂肪移植后成活體積的比較

脂肪移植術(shù)后3 個月，剝離移植物，采用排水法測量各組移植物成活體積（ml）。結(jié)果顯示，下層移植物成活體積為（0.51±0.15）ml，上層移植物（0.32± 0.11）ml 和中層移植物（0.38±0.13）ml，3組間移植物 成活體積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.453，P= 0.000）；下層移植物成活體積高于上層和中層（t= 3.538 和2.269，P=0.002 和0.033）。上層和中層移植 成活體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.122，P= 0.589）。見圖1。

圖1 3組移植物成活體積比較

2.2 各組移植物的成活質(zhì)量評估

上層和中層移植物脂肪細胞形成大量囊泡并被纖維組織包裹或分隔，完整的脂肪細胞較少。采用半定量原則，結(jié)果顯示：3 層移植物囊泡得分比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且下層移植物囊泡的得分低于上層和中層移植物體積（t=6.365 和4.895，均P=0.000）；而上層和中層比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。3 層纖維化程度得分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且下層纖維化程度低于上層和中層（t= 5.357 和6.215，均P=0.000）；而上層和中層比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3 層完整脂肪細胞數(shù)得分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；下層完整脂肪細胞數(shù)高于上層和中層（t=5.091 和5.195，均P= 0.000）。而上層和中層完整脂肪細胞數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1和圖2。

2.3 移植物新生血管密度評估

下層移植物新生血管密度（6.5±0.5）條，中層（3.4±0.7）條，上層（3.2±0.6）條，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=126.066，P=0.000），下層移植物新生血管密度高于中層及上層（t=13.79 和11.14，均P= 0.000）；上層移植物新生血管密度與中層比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.704，P=0.490）。見圖3。

表1 3 層脂肪移植物HE 染色成活質(zhì)量比較（n =12，分，±s）

表1 3 層脂肪移植物HE 染色成活質(zhì)量比較（n =12，分，±s）

注：?與下層比較，P ＜0.05。

組別 囊泡 纖維化 完整脂肪細胞上層 1.6±0.3? 2.1±0.5? 2.9±0.4?中層 1.5±0.4? 2.2±0.4? 2.8±0.4?下層 0.6±0.4 1.1±0.4 3.8±0.4 F 值 26.13 37.371 18.155 P 值 0.000 0.000 0.000

圖2 各組脂肪成活質(zhì)量比較（HE×200）

圖3 各組移植物血管密度比較（免疫組織化學(xué)×200）

3 討論

自體脂肪移植手術(shù)術(shù)后早期填充效果較好，隨著時間的推移，移植后脂肪組織逐漸被吸收，導(dǎo)致填充體積及質(zhì)量減少，影響術(shù)后效果，嚴重妨礙自體脂肪移植進一步臨床應(yīng)用，曾一度被傳統(tǒng)的生物填充材料所取代[4-5]。隨著脂肪抽吸術(shù)及Coleman 技術(shù)的興起[6]，自體脂肪移植成活率及脂肪組織成活質(zhì)量較以前均有明顯改善。目前整形外科醫(yī)師按Coleman 技術(shù)離心提純脂肪后就直接用于脂肪移植，并未對Coleman 方法提純后的進一步量化；本研究的目的就是進一步探究Coleman 方法離心后的不同層次的脂肪移植后成活情況，更好地指導(dǎo)臨床。

本研究發(fā)現(xiàn)，Coleman 方法離心后的下層的脂肪移植后成活體積、成活質(zhì)量及新生血管密度均高于中、上層。其原因可能為以下幾點：①離心后由于離心力的影響造成干細胞分布不同，既往研究已經(jīng)表明脂肪干細胞能夠分泌多種生長因子促進血管化，提高移植物成活率[7-9]。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果基本一致[10-11]，脂肪干細胞多的下層，其成活的體積，血管密度均優(yōu)于中、上層；②由于離心力的影響，體積較大較重脂肪細胞可能位于上層，HE 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)上層脂肪組織中形成大量的囊泡。

雖然脂肪干細胞能夠提高脂肪移植的成活質(zhì)量，但是許多缺點制約其臨床應(yīng)用。首先：脂肪干細胞的獲取及提純過程都是在實驗室完成，其過程復(fù)雜，容易形成污染；其次，脂肪干細胞回輸過程中安全性還需進一步探究；本研究結(jié)果說明如果單純移植Coleman 方法提純的下層脂肪組織能夠提高脂肪移植成活率，值得臨床推廣。