龐中化，王志剛，成小蘭，胡春萍，曹鵬

江蘇省中醫(yī)藥研究院/南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028

全蝎為鉗蝎科動物東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥體，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)的功效[1-2]。全蝎作為動物入藥在我國有著悠久的歷史，臨床上廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、小兒驚風(fēng)、癲癇、無名腫痛等[3-6]。由于全蝎藥材價格高，且通常以粉末、中成藥等形式入藥，外部形態(tài)不完整或被破壞，混偽品增多，給全蝎藥材鑒定帶來極大的困難。線粒體COI基因被公認(rèn)為動物界中標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼基因[7]。基于COI基因的中藥DNA條形碼技術(shù)建立和推廣應(yīng)用，有利于實現(xiàn)中藥鑒定客觀化、規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化。本研究擬利用DNA條形碼COI序列對全蝎進行鑒定研究，通過對樣品標(biāo)準(zhǔn)序列進行測序，建立全蝎DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)全蝎的標(biāo)準(zhǔn)化快速化鑒定，為后續(xù)全蝎藥材的分子鑒定提供新的方法。

1 材料

1.1 樣品采集及鑒定

東亞鉗蝎采自山東泗水、山西呂梁、河南伊川、河北邯鄲、陜西綏德、內(nèi)蒙古清水河、寧夏鹽池、甘肅天水、青海貴德等地。所采集樣本經(jīng)南京師范大學(xué)戴建華教授鑒定，均為鉗蝎科動物東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch，標(biāo)本均保存于江蘇省中醫(yī)藥研究院資源中心。偽品家雞雞肉購買自南京月苑菜市場。全蝎及其混偽品信息見表1。

1.2 儀器及試劑

水浴鍋(XMTD-8222，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；超速離心機(Eppendort 22331 Hamburg，德國Eppendorf公司)；ABI PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；瓊脂糖凝膠電泳儀(PowerPac UnlversalTMPower Supply，美國伯樂Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR(美國伯樂Bio-Rad公司)。

瓊脂糖凝膠粉(BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10)；染料(GelRedTM10000X inwater)；聚合酶(EneraldAmp Max PCR Master Mix 2X Premix)；引物(金斯瑞生物科技有限公司合成)；ddH2O；DL 2000 DNA Marker[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]；基因組DNA小量試劑盒購買自AxyPrep。測序工作委托金斯瑞生物科技有限公司完成。

2 方法

2.1 全蝎基因組DNA提取

從液氮中取出保存的全蝎樣本，放入研缽進行研磨使組織充分破碎，后加入1.5～2.0 mL 56 ℃預(yù)熱的PBS溶液，繼續(xù)研磨至組織溶液分布均勻。后續(xù)提取DNA步驟按照AxyPrep基因組DNA小量試劑盒依次完成實驗。

表1 全蝎樣品及混偽品來源信息

2.2 COI基因的PCR擴增

用試劑盒提取獲得的基因組DNA，利用通用引物(LCOI490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG與HCO2198：TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)進行擴增[8]。40 μL PCR體系中包括：PCR Master Mix 20 μL，引物L(fēng)COI490與HCO2198各1 μL，DNA 4 μL以及去RNA無菌水14 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)；4 ℃保存。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳及測序工作

用電子天平稱取1 g瓊脂糖粉，置于裝有50 mL 1X TAE溶液的錐形瓶中，用微波爐加熱至完全溶解，冷卻片刻后加入5 μL染料，搖晃至充分混勻，倒入膠槽等待其完全冷卻凝固。取3 μL PCR擴增產(chǎn)物和DL2000 DNA Marker在2%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存，以確定COI目的序列被準(zhǔn)確擴增。PCR產(chǎn)物進行雙向測序，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

2.4 測序數(shù)據(jù)的拼接及分析

返回的序列數(shù)據(jù)采用Chromas軟件打開。樣品經(jīng)送測序完成后均獲正向和反向兩條序列，將同正向序列比對，反向序列進行反向補，校正結(jié)果，確定序列準(zhǔn)確無誤。然后在NCBI中用Blast程序進行相似性檢索，以確定基因片段的準(zhǔn)確性。用Mega軟件對上述序列進行比對。整理所得數(shù)據(jù)，采用NJ(鄰接)法對序列構(gòu)建一個系統(tǒng)聚類樹，同時再把所有序列用MEGA 6.06軟件比對并對其進行遺傳距離等分析。

3 結(jié)果

3.1 東亞鉗蝎樣本的野外采集及流通市場調(diào)研

我們采集的東亞鉗蝎正品均為野外采集，蝎子為晝伏夜出物種，晚上出來活動及捕食。采樣過程：東亞鉗蝎在紫外燈光的照射下發(fā)熒光，很容易辨別，通常在蝎子容易出沒的農(nóng)村山腳下，石頭縫內(nèi)容易捕捉到，采集的樣本為東亞鉗蝎主產(chǎn)區(qū)的大部分范圍，具體的采樣地點參見表1。活體樣本放入整理箱內(nèi)帶回南京實驗室，由南京師范大學(xué)戴建華教授進行個體鑒定。我國國內(nèi)蝎子的主要流通方式：當(dāng)?shù)剞r(nóng)民采集，每隔幾天會有相應(yīng)的小販到農(nóng)民處收購，后有更大的商販再從小商販?zhǔn)种惺召?，最后主要于洛陽中藥材市場集散交易，也有藥廠直接從大商販處定點產(chǎn)地采購，最終東亞鉗蝎被炮制成全蝎飲片進入中藥廠或各大藥店及中醫(yī)醫(yī)院入藥使用。

至于混偽品，全蝎打成粉后呈土黃色，與雞肉粉顏色相仿，通過常規(guī)的形態(tài)學(xué)鑒定往往很難區(qū)分，加上不法商家的一些偽造手段，導(dǎo)致藥材相對混亂。因此亟需一種新的快速鑒定方法，來鑒定全蝎藥材中的混偽品，繼而有效幫助建立良好的全蝎藥材市場秩序。

3.2 東亞鉗蝎DNA提取與PCR擴增

實驗結(jié)果表明，東亞鉗蝎的COI基因片段可用通用引物擴增出來，長度與DL2000 marker 700 bp序列相近，與理論大小(658 bp)一致，且無非特異性擴增(見圖1)。PCR產(chǎn)物可用于測序，測序成功率為100%。本實驗共測序東亞鉗蝎正品310份，前期實驗?zāi)z電泳驗證東亞鉗蝎的COI基因片段被成功擴增出來，且無非特異性條帶，證明引物序列及PCR條件穩(wěn)定可靠，后續(xù)樣本PCR產(chǎn)物直接送至金斯瑞公司測序。

圖1 COI基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定

3.3 全蝎單元型間遺傳距離及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

本次研究共采集東亞鉗蝎正品310條序列共有35個單元型。35個全蝎單元型之間的遺傳距離在0.14%～5.42%，在種內(nèi)遺傳距離范之內(nèi)，表明所分析的個體為同一個種。東亞鉗蝎單元型多樣性Hd=0.970，核苷酸多樣性Pi=0.031 27。整個種群高的單元型多樣性和核苷酸多樣性(h>0.5，π>0.5%)意味著種群是由多個地方種群混合而成的大而穩(wěn)定的群體，或分化支系的二次接觸形成。

如表2所示，對不同采集地區(qū)的東亞鉗蝎進行分析，顯示種群內(nèi)遺傳距離范圍為0.00%～3.48%。其中種群1(山東泗水野生種群)、種群2(山東泗水養(yǎng)殖場種群)、種群4(山東沂水鳳凰養(yǎng)殖場種群)、種群5(山東蘭陵野生種群)、種群6(山東蒙山養(yǎng)殖場種群)、種群8(山西平陸安鋪養(yǎng)殖場種群)、種群12(陜西榆林開源養(yǎng)殖場種群)內(nèi)遺傳距離在2.56%～3.46%，明顯大于其他種群內(nèi)的遺傳距離。東亞鉗蝎養(yǎng)殖場種群的遺傳距離明顯高于其他野生種群，推測為因適應(yīng)養(yǎng)殖的需要，養(yǎng)殖場對當(dāng)?shù)夭东@的東亞鉗蝎與其他地區(qū)的優(yōu)勢種進行了雜交，因此其遺傳距離明顯高于其他野生種群。

3.4 系統(tǒng)發(fā)生分析

如圖2所示，基于東亞鉗蝎COI序列構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，研究東亞鉗蝎物種的進化關(guān)系。本次分析同時加入已經(jīng)報道的東亞鉗蝎序列JF700146.1、JF700145.1[8]和ZGYD0186[9]，已報道的3條序列均涵蓋于本研究采樣分析的35個單元型中。JF700146.1、JF700145.1和ZGYD0186序列均可以有效聚類，其中JF700146.1與QX0006MSY(山東蒙山地區(qū))為同一單元型，JF700145.1與QX0003HDY(河北邯鄲地區(qū))為同一單元型，ZGYD0186與QX0001LYY(河南伊川地區(qū))為同一單元型。偽品家雞肌肉粉末(鳥綱)可以很明顯地與東亞鉗蝎(蛛形綱)正品分開，顯示出于COI基因在種間鑒定的準(zhǔn)確性?；贑OI基因的全蝎DNA條形碼技術(shù)鑒定正偽品有效、可行。在我們的樣本采集中，來自寧夏鹽池縣青山鄉(xiāng)海子塘野生種群、山東沂水前官莊村附近野生種群和青海海南藏族自治州貴德縣河西鎮(zhèn)園藝村野生種群可以聚類在一起；而來自陜西榆林開源蝎業(yè)有限公司王家溝養(yǎng)殖場種群、內(nèi)蒙古呼和浩特清水河縣城關(guān)鎮(zhèn)八龍灣村野生種群及山西運城平陸縣曹川鎮(zhèn)下澗村野生種群較為離散，分布在不同的分支，顯示出該地區(qū)東亞鉗蝎樣本的基因多樣性。東亞鉗蝎作為地球生物的“活化石”，已在地球上存活超過2億年，進化上即便相對保守的COI基因，在種內(nèi)的突變也要顯著高于其他物種。

表2 全蝎種群內(nèi)(對角線值)及種群間遺傳距離

圖2 基于COI序列構(gòu)建的全蝎NJ樹

4 討論

全蝎是一種名貴的中藥材，又名鉗蝎、全蟲、蝎子，古書上稱蠆。在中國產(chǎn)地達十幾個省份，有十余種，統(tǒng)稱東亞鉗蝎?！妒癖静荨酚涊d，入藥有1100多年的歷史，因主要產(chǎn)于沂蒙山區(qū)腹地的臨朐、沂水、沂源、蒙陰、平邑等縣，故名沂蒙全蝎。但是隨著我國人口的不斷增長以及中藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，全蝎藥材市場出現(xiàn)大量的混偽品，比如全蝎打成粉后與雞肉顏色相仿，通過傳統(tǒng)方法很難鑒別。本課題通過野外樣本采集，采集了主產(chǎn)區(qū)的東亞鉗蝎正品，并從市場上購買偽品家雞雞肉，通過DNA提取、PCR擴增COI基因，建立基于COI基因的東亞鉗蝎正品數(shù)據(jù)庫；通過數(shù)據(jù)庫比對，很容易將正品全蝎與偽品家雞進行區(qū)分，而且兩者相差很大。東亞鉗蝎為無脊椎動物蛛形綱下的生物，而家雞為卵生的脊椎動物，在進化上兩者差得較遠，通過COI數(shù)據(jù)庫比對很容易進行快速鑒定，可以看出，DNA條形碼技術(shù)能高效、準(zhǔn)確地鑒別中藥材全蝎及其混偽品，繼而有效幫助建立良好的全蝎藥材市場秩序。