尹延偉，孫倩倩，沈 勇，胡愛民，王 琦，陳大偉，趙炫柱，石 進(jìn)△

(1.空軍特色醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科，北京 100142;2.北京衛(wèi)戍區(qū)第九離職干部休養(yǎng)所 100021;3.武警河北省總隊(duì)醫(yī)院綜合病房，石家莊 050081;4.空軍特色醫(yī)學(xué)中心急診部，北京 100142)

動(dòng)脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病、外周血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)[1]。炎性反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化病變過程中發(fā)揮著重要的作用[2]。研究證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中泡沫細(xì)胞的形成與脂質(zhì)代謝紊亂及炎性反應(yīng)密切相關(guān)[3]。因此，積極探討炎性反應(yīng)在泡沫細(xì)胞形成過程中的機(jī)制和關(guān)鍵的調(diào)控分子，對(duì)尋找防治動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)具有重要意義。

血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)在抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)方面發(fā)揮重要的作用。近年研究表明HO-1在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用[4]。Toll樣受體4(Toll like recepter 4,TLR4) 是人體啟動(dòng)先天性免疫和炎性反應(yīng)的重要模式識(shí)別受體，其在人體中主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，同時(shí)在動(dòng)脈壁的內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞 (vascular smooth muscle cells,VSMCs)、纖維原細(xì)胞等表面也有表達(dá)。TLR4可通過激活下游核因子-κB(NF-κB)炎癥信號(hào)通路參與機(jī)體的動(dòng)脈粥樣硬化炎性反應(yīng)過程[3,5]。本研究在C57BL/6J背景野生型小鼠與TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠中對(duì)HO-1在VSMCs泡沫樣變過程中的具體作用進(jìn)行探討，旨在為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～8周齡C57BL/6J背景野生型小鼠與TLR4-/-小鼠分別購(gòu)自陸軍特色醫(yī)學(xué)中心野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心與上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用小鼠均為雄性小鼠。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)液、胰酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司、胎牛血清(FBS)、青素溶液、鏈霉素溶液氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)購(gòu)自廣州奕源生物有限公司；β-actin一抗、TLR4一抗、HO-1一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；油紅O、HO-1激動(dòng)劑鈷原卟琳(CoPPIX)、HO-1抑制劑鋅卟啉(ZnPPIX)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；山羊抗小鼠二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 小鼠麻醉后取胸主動(dòng)脈，組織貼塊法培養(yǎng)原代VSMCs。VSMCs均勻接種于培養(yǎng)皿中，用含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；采用胰酶消化液進(jìn)行傳代，選取3～6代狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行分組：空白對(duì)照組：VSMCs不加任何干預(yù)因素；ox-LDL組：加ox-LDL (80 μg/mL)刺激72 h；TLR4-/-+ox-LDL組：TLR4-/-VSMCs加ox-LDL(80 μg/mL)刺激72 h；CoPPIX+ox-LDL組：CoPPIX(50 μmol/L)預(yù)先處理VSMCs 12 h后再加入ox-LDL(80 μg/mL)刺激72 h；ZnPPIX+ox-LDL組：ZnPPIX(50 μmol/L)預(yù)先處理VSMCs 12 h后再加入ox-LDL(80 μg/mL) 刺激72 h。

1.2.2油紅O染色 各組VSMCs首先用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，然后用10%多聚甲醛固定VSMCs 20 min，在避光條件下用油紅O工作液染色VSMCs 30 min，最后應(yīng)用去離子水沖洗VSMCs后顯微鏡下觀察。

1.2.3膽固醇水平的檢測(cè) VSMCs膽固醇水平的檢測(cè)方法依據(jù)XUE等[6]的研究。各組VSMCs首先在離心管中應(yīng)用萃取液(100 μL異丙醇)提取脂質(zhì)成分；然后應(yīng)用超聲破碎儀將VSMCs充分破碎，在1 500×g條件下離心10 min，收集離心管中的上清液；最后采用酶法檢測(cè)VSMCs中膽固醇水平。測(cè)定的結(jié)果根據(jù)細(xì)胞蛋白水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.4Western blot 細(xì)胞裂解法提取各組VSMCs蛋白并定量檢測(cè)；50 μg蛋白樣品上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加一抗(HO-1一抗稀釋比例1∶1 000；TLR4一抗稀釋比例1∶1 000；β-actin一抗稀釋比例1∶1 000)4 ℃孵育過夜，緩沖液洗脫后，加二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，緩沖液洗脫。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法曝光，最后應(yīng)用Lab4.6軟件對(duì)掃描的Western blot圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5ELISA VSMCs培養(yǎng)液中炎癥因子水平的檢測(cè)方法依據(jù)本課題組之前的研究[7]。簡(jiǎn)而言之，首先收集 VSMCs培養(yǎng)液，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、對(duì)照孔、待測(cè)樣品孔，酶標(biāo)板上覆膜，室溫條件下靜置2 h，倒盡板孔中的液體并洗滌5次；然后每個(gè)板孔中添加100 μL IL-6或TNF-α偶聯(lián)物，加蓋覆膜，室溫靜置2 h；倒盡板孔中液體并再次洗滌5次；每個(gè)板孔中添加100 μL底物溶液，于暗室(室溫條件下)靜置30 min；最后每個(gè)板孔中添加100 μL終止液，搖晃反應(yīng)3～5 min；用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄450 nm處吸光度(A)值。

2 結(jié) 果

2.1ox-LDL顯著促進(jìn)VSMCs細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集 VSMCs與ox-LDL共同孵育72 h后，VSMCs內(nèi)有大量脂滴形成，符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)；而空白對(duì)照組VSMCs內(nèi)未見脂滴形成。此外，細(xì)胞膽固醇水平測(cè)定結(jié)果也顯示，與空白對(duì)照組VSMCs相比，ox-LDL組VSMCs細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A:油紅O染色；C:膽固醇水平檢測(cè)；C:TLR4 Western blot及其表達(dá)分析；D:IL-6表達(dá)水平檢測(cè);E:TNF-α表達(dá)水平檢測(cè)；a:P<0.05，與空白對(duì)照組比較

圖1VSMCs泡沫樣變及膽固醇、TLR4、IL-6、TNF-α表達(dá)水平的檢測(cè)

A:油紅O染色；B:膽固醇水平檢測(cè)；C:HO-1表達(dá)水平檢測(cè)；a:P<0.05，與空白對(duì)照組比較；b:P<0.05，與ox-LDL組比較

圖2VSMCs泡沫樣變、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集情況及HO-1表達(dá)水平的檢測(cè)

A:TLR4 Western blot及其表達(dá)分析；B:IL-6表達(dá)水平檢測(cè);C:TNF-α表達(dá)水平檢測(cè)；a:P<0.05，與空白對(duì)照組比較；b:P<0.05，與ox-LDL組比較

圖3VSMCsTLR4、IL-6、TNF-α表達(dá)水平的檢測(cè)

2.2ox-LDL刺激通過激活TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)促進(jìn)VSMCs泡沫樣變 ox-LDL組中ox-LDL刺激較空白對(duì)照組顯著誘導(dǎo)了VSMCs內(nèi)大量脂滴聚積，也顯著上調(diào)了TLR4及其介導(dǎo)的炎癥因子(IL-6、TNF-α)的表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而對(duì)于TLR4-/-+ox-LDL組，ox-LDL刺激較空白對(duì)照組并不能有效促進(jìn)VSMCs內(nèi)脂滴聚積；此外，ox-LDL刺激也不影響TLR4-/-VSMCs內(nèi)TLR4及其介導(dǎo)的炎癥因子(IL-6、TNF-α)的表達(dá)水平，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、圖3。

2.3激活HO-1抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫樣變 用CoPPIX預(yù)先處理VSMCs激活HO-1后再加入ox-LDL刺激，CoPPIX+ox-LDL組VSMCs內(nèi)脂滴聚積明顯較ox-LDL組減輕；而用ZnPPIX預(yù)先處理VSMCs抑制HO-1后再加入ox-LDL刺激，ZnPPIX+ox-LDL組VSMCs內(nèi)脂滴聚積情況較ox-LDL組更加明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，見圖2。

2.4HO-1下調(diào)TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫樣變 用CoPPIX預(yù)先處理VSMCs激活HO-1后再加入ox-LDL刺激，CoPPIX+ox-LDL組并不能有效上調(diào)TLR4及其介導(dǎo)的炎癥因子(IL-6、TNF-α)的表達(dá)水平，與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；進(jìn)一步應(yīng)用ZnPPIX預(yù)先處理VSMC抑制HO-1后再加入ox-LDL刺激，ZnPPIX+ox-LDL組TLR4及其介導(dǎo)的炎癥因子(IL-6、TNF-α)的表達(dá)水平較ox-LDL組上調(diào)更加明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種動(dòng)脈血管進(jìn)行性堵塞的慢性疾病。動(dòng)脈粥樣硬化作為多種心腦血管疾病、外周血管疾病發(fā)生的共同病理基礎(chǔ)[1]，目前其已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)引起死亡的主要原因之一。因此，積極探討動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性疾病的防治具有重要的指導(dǎo)意義。泡沫細(xì)胞的形成是動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)生發(fā)展過程中非常重要的病理過程[3]。泡沫細(xì)胞主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞及VSMCs。然而，相比巨噬細(xì)胞，目前關(guān)于VSMCs源性泡沫細(xì)胞形成的具體機(jī)制研究很少。

慢性炎性反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)生、發(fā)展的一大病理基礎(chǔ)[3]。TLR4 是啟動(dòng)免疫和炎性反應(yīng)的重要膜受體，其在體內(nèi)引發(fā)炎性反應(yīng)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。有研究顯示TLR4參與動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展過程，并與泡沫細(xì)胞的形成密切相關(guān)[3,5,7]。本研究中，筆者成功應(yīng)用ox-LDL刺激C57BL/6J背景野生型小鼠來(lái)源VSMCs誘導(dǎo)其泡沫樣變，并檢測(cè)TLR4及其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。結(jié)果提示ox-LDL刺激在明顯誘導(dǎo)VSMCs泡沫樣變的同時(shí)可顯著激活TLR4及其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)；而對(duì)于TLR4-/-小鼠來(lái)源的 VSMCs，ox-LDL刺激并不能有效誘導(dǎo)VSMCs的泡沫樣變，此外ox-LDL刺激也不能有效激活TLR4-/-小鼠來(lái)源VSMCs內(nèi)炎性反應(yīng)。說(shuō)明VSMCs泡沫樣變過程中伴隨著TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)激活，而TLR4缺陷損害ox-LDL對(duì)VSMCs泡沫樣變的促進(jìn)作用。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在VSMCs泡沫樣變的過程中發(fā)揮非常重要的作用。

HO-1是動(dòng)物體內(nèi)重要的保護(hù)性蛋白，在人體血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及VSMCs等細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，可被各種化學(xué)和生理應(yīng)激所激活，如炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及內(nèi)毒素等。有研究表明HO-1可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化病變中TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的調(diào)控，如激活HO-1可能通過影響TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)而抑制VSMC增殖與遷移[8-10]。但VSMC中激活的HO-1是否通過影響TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)參與VSMC內(nèi)脂質(zhì)聚積和細(xì)胞的泡沫樣變過程，目前還未見有文獻(xiàn)報(bào)道。基于以上研究筆者推測(cè)：激活HO-1可通過干擾TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)而影響VSMC泡沫樣變。為了驗(yàn)證以上假設(shè)，筆者應(yīng)用HO-1激動(dòng)劑和抑制劑分別激活和抑制HO-1表達(dá)，觀察HO-1表達(dá)變化對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫樣變的影響，同時(shí)檢測(cè)TLR4及其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)激活情況。結(jié)果顯示激活HO-1顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC泡沫樣變，而抑制HO-1進(jìn)一步促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC泡沫樣變；同時(shí)在激活HO-1狀態(tài)下，ox-LDL刺激不能有效激活TLR4及其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，而抑制HO-1后再加入ox-LDL刺激，TLR4及其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)較單獨(dú)ox-LDL刺激激活更加明顯。說(shuō)明激活HO-1可通過下調(diào)TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMCs泡沫樣變。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在VSMC泡沫樣變過程中HO-1可通過下調(diào)TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)抑制VSMCs對(duì)脂質(zhì)的攝取進(jìn)而阻礙泡沫樣變的發(fā)生。以上結(jié)論為動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性疾病的防治提供了新的理論基礎(chǔ)。