楊光昕，蘇悅，李冰蓮，孔聰，黃宣運(yùn)，張璇，于慧娟*，韓峰

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090; 2.上海理工大學(xué)環(huán)境與建筑學(xué)院，上海 200093)

孔雀石綠(malachite green，MG)是一種人工合成的三苯甲烷類工業(yè)染料，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常被用作抗菌劑、殺蟲劑和防腐劑。但MG可在生物體內(nèi)蓄積，具有致癌、致畸、致突變作用，且其主要代謝物隱性孔雀石綠(leuco malachite green，LMG)在生物體內(nèi)殘留時(shí)間較長(zhǎng)，毒性更強(qiáng)[1]。因此，包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家或地區(qū)均將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥，規(guī)定水產(chǎn)品中不得檢出MG。但由于MG抗菌效果好、廉價(jià)易得，部分養(yǎng)殖戶仍在違規(guī)使用，導(dǎo)致市場(chǎng)上在售的水產(chǎn)品中MG仍偶有檢出，嚴(yán)重威脅了消費(fèi)者的身體健康[2]。

目前用于檢測(cè)水產(chǎn)品中MG的方法主要有液相色譜法[3-5]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-8]，雖然這些方法靈敏度及準(zhǔn)確度較高，但所需儀器價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)，不適于快速高通量分析檢測(cè)。免疫分析方法具有操作快速便捷、成本低、靈敏度高及高通量等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于食品中污染物的分析檢測(cè)[9-12]。

生物素-親和素放大酶聯(lián)免疫方法(BA-ELISA)是將生物素-親和素系統(tǒng)(BAS)與ELISA相結(jié)合的免疫分析方法，該方法將生物素標(biāo)記在抗體上，由于每個(gè)親和素可以和多個(gè)生物素化大分子結(jié)合，再結(jié)合酶的放大作用，雙重信號(hào)放大作用有效提高了傳統(tǒng)ELISA方法的靈敏度[13-16]。黃登宇等[17]建立了競(jìng)爭(zhēng)BA-ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物組織中的呋喃西林代謝物，該方法重現(xiàn)性好，靈敏度較ELISA方法提高了近一個(gè)數(shù)量級(jí)。Sun等[18]建立了檢測(cè)飲料中鄰苯二甲酸二異辛酯的BA-ELISA體系，最低檢測(cè)限IC10可達(dá)0.007 4 μg/L，靈敏度較ELISA有了較大提高。Bu等[19]建立了檢測(cè)水中溴代阻燃劑的BA-ELISA體系，該方法快速便捷，靈敏度可達(dá)0.006 7 ng/mL。較高的靈敏度和便捷性使得BA-ELISA在食品中污染物的快速分析篩查方面具有較好的應(yīng)用前景。然而，目前該方法在水產(chǎn)品中污染物的分析檢測(cè)中應(yīng)用相對(duì)較少，因此，本研究在制備生物素化抗體的基礎(chǔ)上，擬通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立檢測(cè)水產(chǎn)品中MG含量的BA-ELISA方法，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中MG殘留量的快速分析篩查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑材料與儀器

明膠、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(SA-HRP)和96孔酶標(biāo)板均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；親和素、鏈霉親合素和N-羥基琥珀酰亞胺生物素(BNHS)購(gòu)自sigma公司；3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)和H2O2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MG、LMG、結(jié)晶紫、無(wú)色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、燦爛綠和隱性燦爛綠等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；抗MG單克隆抗體及其包被原購(gòu)自上海藥巢生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水；樣品來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室采樣留存樣品，均為鱖(Sinipercachuarsi)的陽(yáng)性樣品。

主要儀器：Mnitiskan MK3酶標(biāo)儀、高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀(賽默飛世爾(上海)儀器有限公司)；高速離心機(jī)(湘儀公司)。

1.2 生物素化抗體制備

用碳酸鹽緩沖液(CBS) (0.1 mol/L, pH 9.6)將抗MG單克隆抗體(3 mg/mL)稀釋至1.5 mg/mL，取1 mL于錐形瓶中，加入210 μL 二甲亞砜(DMSO)溶解的BNHS溶液(1 mg/L)，室溫下緩慢攪拌4 h；將反應(yīng)后的溶液轉(zhuǎn)至透析袋中，用PBS作為透析液透析2 d，每天換水3～4次；透析后所得溶液即為生物素化抗體，置于-20 ℃冷凍保存，備用。

1.3 方法參數(shù)優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別優(yōu)化了包被原和抗體工作濃度、封閉液、溫育時(shí)間、鹽離子強(qiáng)度及pH等參數(shù)。其中，包被原和抗體的最佳工作濃度采用棋盤法優(yōu)化，封閉液組成、溫育時(shí)間、助溶劑濃度及鹽離子強(qiáng)度等實(shí)驗(yàn)條件通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

用CBS將包被原稀釋至5個(gè)濃度梯度，分別為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000及1∶8 000，用PBS將抗體稀釋至7個(gè)濃度梯度，分別為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000及1∶32 000。在封閉液優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，選擇5%脫脂奶粉、0.5% PEG20 000、1% OVA、0.5%明膠、1%明膠和2%葡萄糖6種封閉液；在抗原與生物素化抗體反應(yīng)階段，37 ℃下分別溫育15、30、45、60、75、90、105和120 min，優(yōu)化溫育時(shí)間；分別以鹽離子強(qiáng)度為0.05、0.1、0.5、1.0、1.5和2.0 mol/L的PBS為抗原抗體反應(yīng)緩沖液，優(yōu)化最佳鹽離子強(qiáng)度；此外，分別以pH值為6、7、8、9和10的PBS為抗原抗體反應(yīng)緩沖液，優(yōu)化最佳緩沖液pH值。所有的單因素實(shí)驗(yàn)均以IC50和A0max為判定指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，其中IC50為目標(biāo)物對(duì)抗體的抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，A0max為最大OD值。

1.4 BA-ELISA方法建立

BA-ELISA基本操作步驟如下：1)用CBS將包被原稀釋至適當(dāng)濃度，將稀釋后的包被原加入酶標(biāo)板(每孔100 μL)中，4 ℃下包被過(guò)夜；2)用PBST緩沖液洗滌后，每孔加入200 μL封閉液，37 ℃下溫育1 h；3)用PBST緩沖液洗滌后，依次加入50 μL待測(cè)樣品，50 μL適當(dāng)濃度的生物素化抗體，37 ℃下溫育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；4)PBST洗滌后，用PBST將SA-HRP 按1∶1 000比例稀釋，取稀釋后的SA-HRP加入酶標(biāo)板(每孔100 μL)中，37 ℃下溫育1 h；5)用PBST洗板5次后，分別向每孔中加入100 μL顯色液 (TMB)，室溫下反應(yīng)15 min；6)加入50 μL硫酸溶液(2 mol/L)終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度。

由吸光值計(jì)算抑制率，進(jìn)而反推計(jì)算樣品中的MG含量。抑制率=(1-A/A0)×100%，其中A為有樣品存在的孔對(duì)應(yīng)的OD值，A0為沒(méi)有樣品存在的孔的OD值。

1.5 樣品前處理

參照王宇等[20]的樣品前處理方法，將樣品勻漿后，取2 g肉糜于離心管中，加入4 mL對(duì)甲苯磺酸溶液，旋渦1 min后超聲10 min，4 500 r/min離心6 min，取上清液，重復(fù)操作兩次，合并上清液，加入2 mL正己烷，旋渦1 min后4 500 r/min離心6 min，下層溶液過(guò)0.2 μm濾膜后進(jìn)行BA-ELISA測(cè)試。

1.6 方法特異性

利用交叉反應(yīng)率(cross reactivity，CR)來(lái)考察方法的特異性，CR(%)=100×IC50(MG)/IC50(其他物質(zhì))。分別選取與MG結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)LMG、結(jié)晶紫、無(wú)色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、燦爛綠和隱性燦爛綠為交叉反應(yīng)對(duì)象，計(jì)算交叉反應(yīng)率，分析方法的特異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 抗原抗體濃度優(yōu)化

抗原抗體反應(yīng)要遵循一定的量比關(guān)系，只有兩者比例相當(dāng)或抗原稍過(guò)剩的情況下，反應(yīng)才能徹底進(jìn)行。采用棋盤法優(yōu)化包被原和生物素化抗體的濃度，并選取OD值接近1.00的孔所對(duì)應(yīng)抗原抗體濃度為最佳工作濃度。包被原的初始質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，稀釋比例和結(jié)果如表1所示。基于節(jié)約抗原抗體的原則，包被原的最佳稀釋比例是1∶2 000，生物素化抗體的最佳稀釋比例為1∶2 000。

表1 包被原和生物素化抗體濃度(稀釋倍數(shù))優(yōu)化

Tab.1 The optimization of coating antigen and biotinylated antibody concentrations

包被原稀釋倍數(shù)Antigendilutionratio抗體稀釋倍數(shù)Antibodydilutionratio1∶5001∶10001∶20001∶40001∶80001∶160001∶320001∶500 1.931.451.241.030.680.470.301∶10001.561.281.160.840.420.320.281∶20001.321.201.030.610.310.280.141∶40001.080.920.820.430.350.230.151∶80000.850.810.660.470.210.190.14

2.1.2 封閉液組成優(yōu)化

封閉液能夠有效地降低免疫分析檢測(cè)中的非特異性吸附和背景值。本實(shí)驗(yàn)分別選用5%脫脂奶粉、0.5% PEG20 000、1% OVA、0.5%明膠、1%明膠和2%葡萄糖作為封閉液，通過(guò)比較不同封閉液處理后的陰性對(duì)照孔的OD值，以 OD值最低時(shí)所對(duì)應(yīng)的封閉液為最佳封閉液。結(jié)果如圖1所示，以1%的明膠為封閉液時(shí)陰性對(duì)照孔的OD值最低，表明采用該封閉液時(shí)，反應(yīng)中非特異性吸附產(chǎn)生的OD值最小，有效地減少實(shí)驗(yàn)中的誤差，因此選擇該封閉液為最佳封閉夜。

圖1 封閉液的優(yōu)化(n=3)Fig.1 The optimization of blocking reagents(n=3)

2.1.3 抗原抗體反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

在抗原與生物素化抗體反應(yīng)階段，分別在37 ℃下溫育15、30、45、60、75、90、105和120 min，觀察抗原抗體反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。通過(guò)比較不同溫育時(shí)間所得的IC50和A0max值，IC50值最小且A0max值接近1.00時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫育時(shí)間為最佳溫育時(shí)間[21]，結(jié)果如圖2所示，最佳溫育時(shí)間為60 min。

圖2 溫育時(shí)間的優(yōu)化(n=3)Fig.2 The optimization of incubation time(n=3)

2.1.4 鹽離子強(qiáng)度的影響

如圖3所示，隨著鹽離子強(qiáng)度的增加，A0max值逐漸變小，IC50值在鹽離子強(qiáng)度為0.1 mol/L時(shí)最小，隨后逐漸升高。這表明在該離子強(qiáng)度下，方法的靈敏度最高，其原因可能是在此條件下，抗原抗體反應(yīng)更加充分。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇鹽離子強(qiáng)度為0.1 mol/L的PBS為抗體稀釋液。

圖3 鹽離子強(qiáng)度的優(yōu)化(n=3)Fig.3 The optimization of salt ions intensity in buffers (n=3)

2.1.5 pH的影響

在抗原抗體反應(yīng)階段，分別考察了不同pH值的緩沖液對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果如圖4所示，當(dāng)緩沖液pH為7.0時(shí)，IC50值最小，為0.98 ng/mL，A0max值為1.08，參照李冰蓮等[21]等方法，選擇IC50值最小所對(duì)應(yīng)的的pH值為最佳實(shí)驗(yàn)條件，因此，本研究選擇該pH為7.0的PBS為反應(yīng)體系緩沖溶液。

圖4 pH的優(yōu)化(n=3)Fig.4 The optimization of pH values(n=3)

2.2 方法的建立

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，即包被原、抗體稀釋倍數(shù)為1∶2 000，封閉液為1%的明膠，溫育時(shí)間60 min，鹽離子強(qiáng)度為0.1 mol/L，pH值為7.0時(shí)，建立檢測(cè)MG的BA-ELISA方法。將MG標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00和50.00 ng/mL，各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液均參照1.4參與樣品前處理。以MG質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)x，以抑制率為縱坐標(biāo)y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖5所示，該方法的線性范圍為0.05～20.00 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=30.02x+53.98(R2=0.99)，以IC20(目標(biāo)物對(duì)抗體抑制率為20% 時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度)為本方法的最低檢測(cè)限，IC20為0.074 ng/mL，即0.037 μg/kg。該方法與ic-ELSA相比[22]，靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法相比較(GB/T 19857—2005)，靈敏度提高了近10倍。

圖5 BA-ELISA檢測(cè)MG的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of BA-ELISA for MG determination

為了檢驗(yàn)該方法的穩(wěn)定性，重復(fù)8次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，在每個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)濃度重復(fù)6次，由此計(jì)算每個(gè)濃度的板內(nèi)變異系數(shù)和板間變異系數(shù)。該方法的板內(nèi)變異系數(shù)為4.22%～9.39%，板間變異系數(shù)為4.58%～10.15%，說(shuō)明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

2.3 樣品檢測(cè)

分別用建立的BA-ELISA和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 19857—2005 中的液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)實(shí)際樣品中的MG，樣品為本實(shí)驗(yàn)室采樣留存的8個(gè)鱖陽(yáng)性樣品，每個(gè)樣品同時(shí)做6個(gè)平行樣，結(jié)果如表2所示。經(jīng)比較，BA-ELISA可以準(zhǔn)確地篩選出含有MG殘留的陽(yáng)性樣品，這也表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性，可以用于實(shí)際樣品中MG的快速篩選檢測(cè)。

表2 BA-ELISA法和LC/MS法檢測(cè)實(shí)際樣品中的MG含量

Tab.2Content of MG detected by BA-ELISAand LC/MS methods in actual samplesn=6

樣品SampleMG 含量/(μg·kg-1)MG contentBA-ELISALC-MS樣品10.72±0.010.58±0.01樣品25.59±0.324.14±0.18樣品32.56±0.122.33±0.11樣品43.26±0.173.29±0.09樣品51.40±0.061.28±0.02樣品61.80±0.062.51±0.13樣品70.39±0.010.44±0.00樣品80.24±0.020.39±0.01

2.4 回收率

在已知MG濃度的樣品(樣品2、5和8)中分別加入系列濃度的MG標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理后，用建立的新方法測(cè)定樣品中MG的加標(biāo)回收率。結(jié)果如表3所示，樣品中添加0.1-10.0 μg/kg含量水平時(shí)，回收率為83.5%～115.0%，變異系數(shù)CV為4.53%～13.80%，這表明該方法準(zhǔn)確度和精密度較高。

表3 基于BA-ELISA檢測(cè)加標(biāo)樣品中MG的回收率

Tab.3 Recoveries of MG detected by BA-ELISA spiked sediment samples

樣品Sample初始含量/(μg·kg-1)Initialcontent添加含量/(μg·kg-1)Additivecontent檢出含量/(μg·kg-1)Detectioncontent回收率/%Recoveryrate變異系數(shù)/%CV樣品25.592.07.26±0.4783.55.215.010.38±0.3395.86.6910.015.22±0.9396.36.81樣品51.401.02.46±0.16106.04.532.03.19±0.4289.56.185.05.96±0.2591.25.42樣品80.240.10.35±0.07110.09.580.20.47±0.08115.010.400.50.73±0.0998.013.80

注：CV中數(shù)值為6組平均數(shù)。

2.5 特異性分析

分別選取與MG結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)LMG、結(jié)晶紫、無(wú)色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、燦爛綠和隱性燦爛綠為交叉反應(yīng)對(duì)象，分析方法的特異性，交叉反應(yīng)率越低，方法特異性越好。該方法對(duì)LMG、無(wú)色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、燦爛綠和隱性燦爛綠的交叉反應(yīng)率均小于5%，對(duì)結(jié)晶紫的交叉反應(yīng)率為115.0%，這表明該方法對(duì)MG和結(jié)晶紫均有較好的選擇性，可以用來(lái)檢測(cè)和篩選樣品中的MG和結(jié)晶紫。

3 結(jié)論

本研究建立了基于生物素和鏈霉親和素放大系統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)水產(chǎn)品中MG含量的方法，優(yōu)化了包被原和抗體工作濃度、封閉液、溫育時(shí)間、鹽離子強(qiáng)度和pH值等實(shí)驗(yàn)條件，并選擇包被原、抗體稀釋倍數(shù)1∶2 000，封閉液為1%的明膠，溫育時(shí)間60 min，鹽離子強(qiáng)度為0.1 mol/L，pH值為7.0為最佳實(shí)驗(yàn)條件。在此條件下，建立的BA-ELISA方法可有效檢測(cè)水產(chǎn)品中的MG含量，其線性范圍為0.05～20.00 ng/mL，最低檢出限為0.037 μg/kg，回收率為83.5%～115.0%，CV為4.53%～13.80%。特異性實(shí)驗(yàn)表明，該方法對(duì)結(jié)晶紫的交叉反應(yīng)率為115.0%，對(duì)LMG、無(wú)色結(jié)晶紫、亞甲基藍(lán)、燦爛綠和隱性燦爛綠的交叉反應(yīng)率均小于5%。綜上所述，該方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，特異性良好，且96孔酶標(biāo)板的使用更加提高了檢測(cè)效率，可以用于水產(chǎn)品中痕量MG的快速高通量分析篩查。