王雪松，張鴻偉,，張曉梅,林黎明,徐杰*,薛長湖

(1. 中國海洋大學食品科學與工程學院， 青島 266003； 2. 青島海關檢驗檢疫技術中心， 青島 266000)

仿刺參(ApostichopusJaponicus)自古以來名列“海八珍”之一，具有很高的經(jīng)濟價值及營養(yǎng)價值[1]。磷脂(phospholipid，PL)是仿刺參脂質組成的重要成分之一，可分為甘油磷脂與鞘磷脂，其基本骨架分別為甘油和鞘氨醇。甘油磷脂是一種兩性分子，一端為親水性的含氮或含磷的頭基，另一端為疏水(親油)性的長烴基鏈[2]。盡管仿刺參中磷脂相對于蛋白質是低含量組分，但其對人體的營養(yǎng)價值仍十分可觀[1]。仿刺參磷脂中富含長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)，如二十碳五烯酸(C20:5 n-3，EPA)和二十二碳六烯酸(C22:6 n-3，DHA)，而膳食PUFA中n-3/n-6比例的增加具有降低血漿脂質濃度[3]，預防心血管疾病[4]，并降低患癌癥風險的作用[5]。

中國仿刺參主要產(chǎn)自遼寧、山東和福建等地。市場上大連仿刺參的價格相對而言較高，相應地也出現(xiàn)了以異地海參冒充遼參高價出售的現(xiàn)象。為了防止少數(shù)商家進行不正當牟利，從而保護消費者的合法權益，保證水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的平穩(wěn)高速發(fā)展，有必要開展仿刺參的產(chǎn)地溯源研究。目前常見的水產(chǎn)品溯源技術主要是根據(jù)穩(wěn)定同位素比率、元素分布和生物分子(DNA、蛋白質和脂質)等信息對產(chǎn)地進行鑒別[6-8]。已有研究利用海參中游離脂肪酸含量差異，通過氣相色譜-質譜聯(lián)用技術實現(xiàn)產(chǎn)地溯源[6]，但需要對脂肪酸進行衍生化，操作復雜且耗時較長，此外，氣相色譜難以檢測不易揮發(fā)的脂質，具有一定局限性，因此，開發(fā)快速、高通量的液相色譜-質譜聯(lián)用方法將使其具有更好的應用潛力。研究表明，作為重要生物活性脂質，磷脂的一系列變化反映了生物體內(nèi)代謝的變化，且海產(chǎn)品的磷脂組成會隨生長的環(huán)境等條件的不同而變化[9-10]。研究不同產(chǎn)地仿刺參磷脂輪廓的差異，不僅能夠為產(chǎn)地溯源和營養(yǎng)學評價提供數(shù)據(jù)支持，還可為研究外界環(huán)境變化對仿刺參代謝的影響提供思路和方法學依據(jù)。

本研究旨在利用UHPLC-ESI-TOF-HRMS技術高靈敏度、高分辨率和高通量的特點，采用脂質組學分析策略對來自3個產(chǎn)地仿刺參的磷脂分子組成、相對含量進行測定，并結合化學計量學方法對獲取的磷脂組數(shù)據(jù)進行信息挖掘，分析確定產(chǎn)地差異分子標志物，在磷脂分子種水平探討仿刺參產(chǎn)地鑒別分析的可行性，并進一步為其營養(yǎng)學評價和代謝組學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2018年11月分別自大連、膠南及威海3個不同產(chǎn)地(下文分別簡寫為DL、JN及WH)的當?shù)厮a(chǎn)品市場購買新鮮仿刺參樣本(體長約25 cm)，去除內(nèi)臟后液氮冷凍，置于-80 ℃暫存。每種仿刺參分別取5個完整個體，冷凍干燥后用高速研磨儀(IKA A11basic，德國)于液氮浴中研碎成粉末，保存于50 mL旋蓋離心管中，-20 ℃凍存，分析待用。

磷脂提取所用三氯甲烷、甲醇和異丙醇均為分析純試劑，購自國藥(上海)集團。流動相所用甲醇、乙腈和異丙醇均為質譜級試劑，購自美國Merck公司。超純水采用Milli-Q Gradent系統(tǒng)制備(18.2 MΩ·cm)。甲酸和甲酸銨購自美國Sigma-Aldrich公司。溶血磷脂酰膽堿(lysophosphocholine，LPC)、磷脂酰膽堿(phosphocholine，PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphoethanolamine，LPE)、磷脂酰乙醇胺(phosphoethanolamine，PE)、磷脂酰甘油(phosphoglycerols，PG)及磷脂酰肌醇(phosphoinositols，PI)的標準品，純度均>99.1%，購自Avanti Polar Lipids公司(Alabaster，USA)。

1.2 實驗儀器

主要儀器包括：ShimadzuNexeraX230A超高效液相色譜儀(島津公司，日本)；Triple TOF 5600+四級桿/飛行時間質譜伙(AB Sciex美國)，配有復合DuoSpray離子源，應用軟件為AnalystTF(版本1.7)；DUC-1C氮吹儀(TAITEX公司，日本)；ABS35-S精密分析天平(梅特勒-托利多公司，瑞士)；CR22GⅡ高速冷凍離心機(HATACHI公司，日本)；A11basic高速研磨儀(IKA公司，德國)。

1.3實驗方法

1.3.1 樣品前處理

采用改良型Folch法[11]進行磷脂提取。取制備好的仿刺參粉末0.1 g，使用6 mL氯仿/甲醇(2∶1，V/V)振蕩提取10 min，加入2 mL超純水，渦旋20 s，5 000 r/min離心10 min，轉移上層至新離心管中(下層氯仿層留置待合并)。向新離心管中加入4 mL氯仿渦旋20 s，靜置5 min，重復提取2次，合并所有氯仿層提取液，氮氣吹干溶劑，并復溶于1 mL的異丙醇/乙腈/水(2∶1∶1，V/V)中，經(jīng)過0.22 μm有機濾膜過濾后于-20 ℃儲存，備用。上樣前超聲30 s。

1.3.2 儀器參數(shù)

色譜條件：Nexera超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；C18柱(50.0 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美國ThermoFisher公司)。流動相A為甲醇/水(65∶35，V/V)，流動相B為甲醇/乙腈(20∶80，V/V)，A、B相均含1 mmol/L甲酸銨。采用梯度洗脫：0～15.0 min，100% A；15.0～17.0 min，0～80% A；17.0～17.5 min，80%～100% A；17.5～18.0 min，100% A。流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃。

質譜條件：Triple TOF 5600+四級桿/飛行時間質譜儀(AB Sciex美國)；ESI負離子模式-4.5 kV，離子化溫度500 ℃，霧化氣(GS1)60 psi，輔助加熱(GS2)35 psi；氣簾氣(CUR)15 psi；掃描范圍m/z120～1 000，IDA自動二級掃描模式；進樣量10 μL。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用Lipidview軟件(版本V1.2，美國AB Sciex公司)中內(nèi)置數(shù)據(jù)庫對樣本中的磷脂輪廓進行自動鑒定，獲得海參的磷脂輪廓信息。并根據(jù)標準品的特征碎片，對自動鑒定的結果進行人工篩選，過濾除去假陽性結果。通過MS-DAIL軟件(版本V3.12，日本RIKEN研究所)，對海參樣品中檢測到的磷脂分子種進行色譜峰對齊以及歸一化預處理，并導入SIMCA-P+軟件(版本V14.0瑞典Umetrics公司)進行多元統(tǒng)計分析，后構建正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)模型，用于尋找不同產(chǎn)地仿刺參磷脂分子標志物。

2 結果與分析

2.1 仿刺參磷脂組分鑒定

仿刺參中LPC和LPE保留時間在4～8 min，PC和PE的保留時間在8～14 min(圖1)。不同產(chǎn)地的仿刺參在總離子流圖上具有差異，說明其磷脂組成不同；為進一步研究造成差異的主要因素，需對仿刺參中磷脂分子種進行鑒定。

首先對仿刺參中的磷脂分子種組成進行了分析。圖2給出了在負離子采集模式下3種產(chǎn)地仿刺參中確認鑒定的磷脂分子種的質荷比-保留時間二維展開圖。如圖2所示，主要磷脂分子種的洗脫時間在2～14 min。磷脂分子種的質荷比主要集中在400～1 000區(qū)間內(nèi)，確認了包括PE、LPE、PC和LPC等主要磷脂亞類約160余種磷脂分子種。

圖1 3種產(chǎn)地仿刺參磷脂總離子流圖Fig.1 TIC of A. japonicus phospholipids from three geographical origins

仿刺參中主要磷脂分子種(至少1個產(chǎn)地的仿刺參中該分子種在其對應磷脂亞類中含量高于5%)總結于表1。由表可知，仿刺參中磷脂以富含C20∶5、C20∶4和C22∶5等多不飽和脂肪酸的分子種為主，如PC(18∶1-20∶5)、PE(18∶1-22∶5)及PI(18∶0-20∶5)等。而溶血型磷脂(LPC、LPE)中則以飽和或單不飽和中長碳鏈脂肪酸為主，如LPC(18∶0)、LPE(18∶1)等，與Lou等[12]對仿刺參脂質輪廓分析結果相一致。不同產(chǎn)地仿刺參中磷脂分子種的相對含量有所不同，說明磷脂輪廓具有進行產(chǎn)地區(qū)分和鑒別的功能。但由于變量數(shù)量較多，利用方差檢驗評估其差異顯著性會導致不可接受的假陽性率(例如，假設規(guī)定的檢驗水準為0.01，則對于n次檢驗，存在假陽性錯誤的概率αn=1-(1-0.01)n,當n增加時，αn趨于1[13])，因此宜采用多元統(tǒng)計模型。

圖2 3種產(chǎn)地仿刺參磷脂分子種鑒定Fig.2 Identification of phospholipid molecular species from A. japonicus samples from three geographical origins

表1 仿刺參中主要磷脂分子種及相對含量

Tab.1 Main phospholipid molecular species and their relative abundances inA.japonicasn=5

磷脂亞類Subclass加合形式Adduct保留時間/minRetentiontime質荷比m/zMass-to-chargeratio磷脂分子種Molecularspecies磷脂相對含量/%RelativeabundanceofphopholipidDLJNWHPC[M+HCOO]-10.95832.5977PC(16:0-20:5)8.1±0.91.9±0.21.5±0.27.99798.5214PC(18:0-20:5)11.5±1.34.1±0.53.7±0.58.35824.5375PC(18:1-20:4)4.2±0.59.3±1.19.6±1.410.01804.5713PC(18:1-20:5)12.4±1.310.8±1.310.5±1.59.05826.5515PC(18:1-22:6)4.2±0.510.7±1.011.7±4.4PE[M-H]-9.39792.5474PE(18:0-22:5)24.3±1.74.8±0.46.3±0.68.42790.5330PE(18:1-22:5)25.4±2.311.9±0.716.2±1.611.34794.5626PE(20:0-20:4)10.0±1.117.4±2.918.2±2.09.41818.5622PE(20:1-22:5)5.7±0.53.3±1.03.4±1.512.18822.5911PE(22:0-20:4)2.9±0.410.8±2.27.9±1.611.30820.5751PE(22:1-20:4)2.6±0.46.7±1.36.8±1.1PI[M-H]-8.41883.5259PI(18:0-20:5)14.5±2.92.1±0.92.7±0.610.06913.5713PI(20:0-20:4)13.7±2.918.7±4.521.2±6.09.44911.5571PI(20:0-20:5)9.4±2.19.0±2.69.7±3.7

續(xù)表1，Tab.1 Continued

注：DL，JN和WH分別表示大連、膠南和威海。下同。

2.2 仿刺參磷脂輪廓數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計分析

2.2.1 基于仿刺參磷脂輪廓的聚類分析

圖3為不同產(chǎn)地仿刺參鑒定的磷脂分子種數(shù)據(jù)PCA-X得分圖。圖中散點間距離表示其在主成分上的差異[14]。如圖3所示，不同產(chǎn)地的仿刺參樣本被分為3類，表明磷脂輪廓能夠將3個產(chǎn)地的仿刺參有效區(qū)分。大連仿刺參與其他產(chǎn)地的磷脂組成差異較大；同屬山東半島的膠南和威海兩個產(chǎn)地仿刺參則較為接近，表明其磷脂組成具有相似性。Yun等[15]所產(chǎn)的仿刺參在DNA序列上存在差異。因此，磷脂輪廓的差異一方面可能與其產(chǎn)地環(huán)境因素有關[16-17]，另一方面，也可能受不同產(chǎn)地仿刺參遺傳物質差異的影響。生物體內(nèi)脂質代謝受生理狀態(tài)等多種因素影響[18]，膠南仿刺參個別樣本超出了PCA-X得分圖的T295%置信區(qū)域，可能是個體差異導致，不影響后續(xù)分析。

圖3 3種產(chǎn)地仿刺參PCA-X分析模型的得分圖Fig.3 Score plot of PCA-X model for differentiating A. japonicus samples from three geographical origins

產(chǎn)地溯源技術的原理是基于不同產(chǎn)地農(nóng)產(chǎn)品光譜特性或化學組成等方面存在的差異進行分析，如張鵬等[19]基于不同產(chǎn)地蘋果中糖分等有機物含量的差異，利用近紅外光譜技術建立了有效的產(chǎn)地鑒別模型。目前，已有研究嘗試根據(jù)海參皂苷指紋圖譜進行產(chǎn)地溯源，但受個體差異等多種因素影響，其結論具有一定局限性[20]。本研究表明，磷脂輪廓可以有效地對不同產(chǎn)地的仿刺參進行區(qū)分，具有進一步篩選對產(chǎn)地差異貢獻較大的磷脂標志物的價值。為了更好地研究不同產(chǎn)地的仿刺參在磷脂輪廓上的差異，需要利用有監(jiān)督作用的多元統(tǒng)計工具OPLS-DA，對不同產(chǎn)地仿刺參磷脂輪廓構建模型進行分析。圖4給出了仿刺參磷脂輪廓的OPLS-DA模型得分圖，其參數(shù)[R2X=0.889(cum)，R2Y=0.979(cum)，Q2=0.954(cum)](其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2標示模型的預測能力，理論上R2、Q2數(shù)值越接近1說明模型越好，通常情況下，R2、Q2高于0.5 (50%)較好)顯示模型的擬合度和預測能力符合要求。如圖4所示，在OPLS-DA模型中樣本類聚度明顯優(yōu)于PCA分析，特別是膠南和威海兩個產(chǎn)地仿刺參的分離更好，且全部樣本都位于PCA-X得分圖的霍特林T2的95%置信區(qū)域內(nèi)，說明該模型對仿刺參產(chǎn)地的鑒別能力優(yōu)于PCA模型。

圖4 3種產(chǎn)地仿刺參OPLS-DA分析模型的得分圖Fig.4 Score plot of OPLS-DA model for differentiating A. japonicus samples from three geographical origins

2.2.2 OPLS-DA兩兩比較及產(chǎn)地差異海參磷脂分子標志物的篩選

聚類分析表明，不同產(chǎn)地仿刺參磷脂輪廓差異顯著。但是，為了篩選對產(chǎn)地差異具有較大貢獻的分子種(即產(chǎn)地差異的磷脂標志物)，需進一步構建OPLS-DA模型進行兩兩比較差異分析。表2給出了OPLS-DA模型兩兩比較的質量評估參數(shù)。所有構建的OPLS-DA模型在擬合優(yōu)度[R2X(cum)，R2Y(cum)]、預測能力Q2(cum)、穩(wěn)健度(R2，Q2的回歸曲線截距)方面均滿足要求[21]，可以用于產(chǎn)地差異磷脂分子標志物的篩選。

表2 3種產(chǎn)地仿刺參磷脂分子標志物篩選OPLS-DA模型質量評估參數(shù)表

Tab.2 Quality evaluation parameters of OPLS-DA models for differentiating phospholipid molecular biomarkers inA.japonicussamples from three geographical origins

序號Number比較組別GroupsR2X(cum)R2Y(cum)Q2(cum)置換檢驗回歸曲線截距RegressioncurveinterceptofpermutationtestRb2Qb21DLvsJN0.9310.9990.9990.204-0.6042DLvsWH0.8930.9990.9980.203-0.3483WHvsJN0.5950.9750.9210.321-0.471

注：回歸曲線截距(Rb2<0.35，Qb2<0.05)時，表示模型穩(wěn)健[22]。

為保證篩選出的磷脂標志物具有統(tǒng)計學意義，根據(jù)磷脂分子種在OPLS-DA模型中的變量投影重要度(variable importance for the projection,VIP)值、變化倍數(shù)(foldchange)和p值(pvalue)對結果進行了過濾，并通過載荷圖刀切置信區(qū)間進行檢驗[23]。最終篩選出10個磷脂分子種作為產(chǎn)地差異磷脂分子標志物(表3)，主要是PE和PC。值得注意的是，磷脂標志物多篩選自膠南-大連、大連-威海兩組模型，而在威海-膠南模型中則較少，這說明膠南和威海兩個產(chǎn)地仿刺參磷脂輪組成差異較小，此結論與PCA聚類分析的結果一致。在未來研究中，通過表面解吸常壓化學電離質譜等檢測技術[24]對少數(shù)產(chǎn)地差異標志物進行快速檢測，有望開發(fā)更加高效的仿刺參產(chǎn)地鑒別方法。此外，脂質是影響農(nóng)產(chǎn)品感官質量和營養(yǎng)成分的重要因素[25]，本研究篩選的磷脂標志物不僅在仿刺參產(chǎn)地溯源方面具有應用潛力，也可以作為仿刺參營養(yǎng)價值評估的重要指標。

表3 仿刺參產(chǎn)地差異磷脂分子標志物

Tab.3 Qualified phospholipid molecular biomarkers ofA.japonicusfrom three geographical origins

序號Number分子種Molecular species統(tǒng)計差異顯著組別Groups with significant difference1LPC(18:0)DL-JN; DL-WH2LPC(20:1)DL-JN3PC(18:0-20:5)DL-JN; DL-WH4PE(22:0-20:4)DL-JN; DL-WH; JN-WH5PE(20:0-20:4)DL-JN; DL-WH6PC(16:0-20:5)DL-JN; DL-WH7PC(18:1-20:4)DL-JN; DL-WH8PE(18:0-22:5)DL-JN; DL-WH9PC(18:1-22:6)DL-JN10PC(18:1-18:2)DL-JN

3 結論

本研究利用UHPLC-ESI-TOF-HRMS分析體系結合多元統(tǒng)計分析模型，建立了仿刺參磷脂組鑒定分析與產(chǎn)地差異磷脂分子標志物篩選方法。PCA分析結果表明，不同產(chǎn)地仿刺參能夠根據(jù)其磷脂輪廓進行有效區(qū)分。通過OPLS-DA模型篩選出10個產(chǎn)地差異磷脂分子標志物(主要是PE和PC)，有望進一步用于開發(fā)仿刺參產(chǎn)地快速鑒別方法。另外，多不飽和脂肪酸被認為是海產(chǎn)品中重要生物活性成分之一，分析發(fā)現(xiàn)篩選的產(chǎn)地差異標志物富含C20:4和C20:5等多不飽和脂肪酸,表明不同產(chǎn)地的仿刺參營養(yǎng)價值可能有所不同。本研究為高值海產(chǎn)品的溯源研究提供了方法學參考，同時為評價不同產(chǎn)地仿刺參營養(yǎng)價值差異提供了數(shù)據(jù)支持。