龍金瑤 ，倪錫森 ，陳劍浩 ，劉 婷，鐘佳男 ，唐嵐芳，肖紹堅(jiān) ，蔡 晶

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，本病發(fā)病率有逐漸上升趨勢(shì)［1］，其主要病理變化是選擇性中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元喪失，紋狀體多巴胺神經(jīng)元含量顯著性減少。由于其直接致病原因是多巴胺神經(jīng)元的喪失即細(xì)胞的凋亡，故延緩或減少細(xì)胞凋亡成為治療PD的一個(gè)重要手段。本實(shí)驗(yàn)通過觀察蓯蓉舒痙方對(duì)魚藤酮葵花油乳液［2］制備的 PD模型大鼠Akt、P-Akt及mTOR蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討該方防治PD的作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 動(dòng)物 48只SPF級(jí)SD健康雄性成年大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供SPF級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施，使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2014-0005。

1.2 主要試劑、藥物及制備 蓯蓉舒痙方由肉蓯蓉、赤芍、制黃精、牡丹皮、丹參等藥物組成，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院提供。藥物制備：將藥品混勻粉碎，加入蒸餾水，浸泡30 min，放入藥壺中大火煮沸后轉(zhuǎn)為小火再煮30 min，將藥汁倒出過濾藥渣；反復(fù)過濾兩次后，將藥汁倒入燒杯中，計(jì)算出高、中、低、劑量濃縮的比例，將燒杯放入水浴鍋隔水進(jìn)行藥汁濃縮（終濃度為0.5 g／mL），將濃縮液置于4℃冰箱中保存。

魚藤酮葵花油乳液：取魚藤酮粉末（美國Sigma公司，批號(hào)：R8875）加入葵花油（美國Sigma公司，批號(hào)：S5007）中，稀釋成 1.5 mg／mL的魚藤酮葵花油乳液，4℃下低溫避光保存。

β-actin抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：66009-1-lg，稀釋比：1∶2 000）；羊抗兔 FITC 抗體（美國 Abcam公司，批號(hào)：ab6717）；羊抗鼠 TRITC抗體（美國 Abcam 公司，批號(hào)：ab6718）；PTEN抗體（美國 Cell Signaling Techonoligy公司，批號(hào)：9188）；mTOR抗體（美國Cell Signaling Techonoligy公司，批號(hào)：2983）；SDS配膠試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、ECL顯色劑、5×上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 GelDOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；DU-650型蛋白分析儀（美國Beckman公司）；-4℃高速冷凍離心機(jī)（德國 Eppendorf公司）。

2 方 法

2.1 PD模型建立及分組 將48只健康雄性大鼠隨機(jī)分為正常組8只、溶劑組8只、造模組32只。造模組大鼠于頭部皮下注射魚藤酮葵花油乳液，每天注射前先給大鼠稱重，按比例注射魚藤酮葵花油乳液每天0.1 mL／100 g，連續(xù)給藥14 d，建立PD模型；正常組不予處理；溶劑組相應(yīng)部位注射葵花油乳液每天0.1 mL／100 g。造模組大鼠出現(xiàn)弓背豎毛，毛色發(fā)黃變臟，活動(dòng)減少，爬壁次數(shù)減少的行為（記為1分）以及出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)或不能直線行走的行為（記為2分）判定為造模成功。把32只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各8只。

2.2 干預(yù)方法 按照人與動(dòng)物體表面積折算（人臨床用量為47 g／d）計(jì)算出高、中、低劑量組的給藥量分別是 10、5、2.5 g／kg，采用蓯蓉舒痙方水煎劑定時(shí)灌胃，每天1次，灌胃前先稱重，按比例灌胃，連續(xù)灌胃2周。

2.3 取材及樣品的制備 取材之前的12 h大鼠停止進(jìn)食，麻醉下斷頭、取腦，分離出中腦紋狀體（前囟后5.2 mm，正中線左右側(cè)1.0 mm，硬膜下9.0 mm），用0.9%氯化鈉溶液洗凈后置于液氮中保存。制備樣品時(shí)，將紋狀體取出后，稱量所需紋狀體，加入 RIPA 裂解液（1∶12.5 μL）充分研磨，靜置 30 min；用移液槍將組織液從研磨管中完全吸出至2 mL離心管中，每管用1 mL注射器吹打20次，放入-4℃冷凍離心機(jī)中離心 15 min（12 000 r／min）；抽取上清液加入 5×上樣緩沖液（1∶4 μL），置于沸水中 10 min，充分變性后取出含紋狀體的混合液（即樣品），放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 Western blot檢測(cè) 從-80℃冰箱中取出樣品，置于沸水中充分溶解5min，將樣品電泳后，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白Mark為參照，根據(jù)蛋白分子量切取條帶，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；轉(zhuǎn)膜成功后搖床封閉2 h，再分別放入對(duì)應(yīng) β-actin 抗體（1∶2 000）、PTEN 抗體（1∶2 000）、mTOR抗體（1∶2 000）4℃搖床過夜；用 TBST洗 3次10 min后分別放入生物素標(biāo)記的羊抗兔FITC抗體（1∶2 000）和羊抗鼠 TRITC 抗體（1∶2 000）搖床1 h；TBST洗滌后，滴加ECL顯色劑（化學(xué)發(fā)光底物和穩(wěn)定劑以1∶1混合），應(yīng)用DU-650型蛋白分析儀檢測(cè)條帶平均光密度值。運(yùn)用Image Lab軟件計(jì)算每組的蛋白含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊則采用LSD－t檢驗(yàn)，方差不齊則采用Games-Howell法。

3 結(jié) 果

與正常組比較，模型組大鼠紋狀體的Akt、PAkt蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組 mTOR、Akt蛋白表達(dá)增加（P＜0.05），中劑量組 PAkt蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）。 見圖 1、表 1。

圖1 4組大鼠紋狀體中Akt、P-Akt、mTOR蛋白表達(dá)比較

表 1 4組大鼠紋狀體 Akt、P-Akt、mTOR 蛋白的表達(dá)變化（）

表 1 4組大鼠紋狀體 Akt、P-Akt、mTOR 蛋白的表達(dá)變化（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

mTOR 0.70±0.18 0.56±0.12 0.60±0.15 0.40±0.151）0.63±0.08 0.88±0.293）組別正常組溶劑組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 8 8 8 8 8 8 Akt 0.94±0.624）0.82±0.19 0.53±0.072）0.72±0.51 0.51±0.233）0.62±0.104）p-Akt 0.87±0.073）0.67±0.034）0.36±0.031）0.26±0.021）0.50±0.011）3）0.49±0.101）

4 討 論

PD是一種由于中腦黑質(zhì)病變致多巴胺能神經(jīng)元衰老死亡而出現(xiàn)以靜止性震顫為主要表現(xiàn)伴有面部表情呆滯、行走緩慢、步態(tài)異常等臨床癥狀的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾?。?］。祖國醫(yī)學(xué)把帕金森病歸屬于“顫證”“不寐”“肝腎陰虛”等的范疇［4］。 《奇證論卷七》曰：“顫振一證，古云木火上盛，腎陰不充，……虛則腎虧，法宜清上補(bǔ)下”，故應(yīng)補(bǔ)腎益精填髓，益氣養(yǎng)血。陸征宇等［5］采用補(bǔ)腎填精方改善了PD患者的運(yùn)動(dòng)癥狀、認(rèn)知功能障礙等。蔡晶教授經(jīng)過長期臨床實(shí)踐，根據(jù)帕金森病的病機(jī)特點(diǎn)，創(chuàng)立了滋腎填精、補(bǔ)益肝腎、活血化瘀的蓯蓉舒痙方［6］，方中君藥肉蓯蓉具有拮抗免疫衰老［7］、減輕細(xì)胞凋亡［8］、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖等的作用，在臨床上配合美多巴等藥物可改善PD有關(guān)癥狀。

在Akt／mTOR通路中，Akt被上游分子激活后，活化的Akt進(jìn)一步導(dǎo)致下游mTOR的磷酸化［9］，進(jìn)而影響和調(diào)控細(xì)胞的凋亡和自噬等［10］。在Akt／mTOR通路中，Akt具有抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活等的作用。mTOR是Akt／mTOR的下游分子,在保護(hù)神經(jīng)元方面具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠紋狀體的Akt、P-Akt顯著降低；蓯蓉舒痙方干預(yù)14 d后，與模型組比較，中劑量組大鼠紋狀體的P-Akt蛋白表達(dá)增高，高劑量組大鼠紋狀體的Akt、mTOR蛋白表達(dá)顯著增高。提示蓯蓉舒痙方可以增加大鼠紋狀體的Akt、P-Akt、mTOR的蛋白含量，促進(jìn) Akt的活化，從而激活A(yù)kt／mTOR通路，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

但本研究僅檢測(cè) Akt、P-Akt、mTOR 3個(gè)蛋白，未能全面檢測(cè)Akt／mTOR通路的全部蛋白，也未能進(jìn)一步做促進(jìn)和抑制實(shí)驗(yàn)，故未能說明中醫(yī)藥治療PD的更深層次機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。