高方園, 焦豐龍, 張養(yǎng)軍, 秦偉捷, 錢小紅

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所, 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室,北京蛋白質(zhì)組研究中心, 國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心-北京, 北京 102206)

外泌體(exosomes)是一類由細胞分泌到胞外的囊泡,最早由Pan[1]和Johnstone[2]在綿羊網(wǎng)織紅細胞中發(fā)現(xiàn)并命名。隨著研究的深入,人們[3]發(fā)現(xiàn)包括血細胞、免疫細胞、癌細胞、干細胞等在內(nèi)的幾乎所有細胞都可以產(chǎn)生外泌體,所產(chǎn)生的外泌體不僅存在于細胞培養(yǎng)液中,也存在于血液、尿液、母乳、唾液、胸腔積液等體液中。與其他兩種胞外囊泡(微囊泡和凋亡小體)相比,外泌體在產(chǎn)生方式、尺寸、密度和內(nèi)容物等方面存在明顯差異。不同于微囊泡“出芽”的形成方式,外泌體主要通過胞吐過程釋放至細胞外:首先細胞膜向內(nèi)凹陷形成早期核內(nèi)體(early endosomes),早期核內(nèi)體進一步內(nèi)陷形成多泡體(multivesicular bodies, MVBs),其中一部分多泡體與溶酶體(lysosome)融合,進而降解;另一部分與細胞膜融合,將其內(nèi)部所包含的囊泡釋放至胞外,即為外泌體[4]。

外泌體具有獨特的物理化學(xué)性質(zhì),其直徑為30～200 nm,密度為1.13～1.19 g/mL,組成包括細胞來源相關(guān)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA、DNA等物質(zhì),在其表面連接有大量的糖鏈,如甘露糖、聚乳糖胺和α-2,6-唾液酸等[5]。外泌體中常見的磷脂包括鞘磷脂、膽固醇、磷脂酰膽堿、神經(jīng)酰胺、磷脂酰膽堿等。但是由于特殊的產(chǎn)生方式,外泌體所含的脂質(zhì)可能與來源細胞膜存在顯著差異。例如,與PC-3細胞相比,PC-3細胞外泌體中含有較高豐度的鞘糖脂、鞘磷脂、膽固醇和磷脂酰絲氨酸[6]。外泌體常見的表面蛋白質(zhì)包括四跨膜蛋白(如CD63、CD9、CD81)、黏附蛋白(如L1CAM、LAMP2)、整合素和糖蛋白(如纖連蛋白)等[7,8],而外泌體囊泡內(nèi)蛋白質(zhì)則與來源細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)密切相關(guān),包含例如熱休克蛋白(HSP70、HSP90)和細胞骨架蛋白(actin、tubulin、cofilin)等[9]。除此之外,外泌體中還攜帶有來源細胞的miRNAs、mRNAs、non-coding RNAs、circular RNAs和DNA等遺傳物質(zhì)。外泌體的完整囊泡結(jié)構(gòu)能夠保護其內(nèi)部生物分子不受體液中各種酶的影響從而保持其完整性和生物活性。例如,外泌體中包含的mRNAs和miRNAs在進入受體細胞后仍具有翻譯蛋白質(zhì)、促進病毒感染等功能[10]。據(jù)估計,單個外泌體含有約≤100拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)和≤10 000拷貝數(shù)的核苷酸[11]。不同細胞來源的外泌體中既包含與細胞形成、結(jié)構(gòu)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)的共有成分,也包含與來源細胞的生物功能相關(guān)的特異分子。如B淋巴細胞、樹突狀細胞、肥大細胞和腸上皮細胞來源的外泌體含有大量的主要組織相容性復(fù)合體蛋白質(zhì)MHC class Ⅱ和MHC class Ⅰ,血小板和T細胞來源的外泌體則包含諸如血管性血友病因子、穿孔素和顆粒酶等特殊蛋白質(zhì)[12],而癌細胞來源的外泌體表面可能含有腫瘤特異的蛋白質(zhì)分子[13]。這類特異分子在外泌體介導(dǎo)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與生理病理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

1 外泌體的研究策略

外泌體包含大量跨膜蛋白質(zhì)和胞內(nèi)蛋白質(zhì),雖然不同細胞來源的外泌體的大部分蛋白質(zhì)組成相近,但是也有少量蛋白質(zhì)具有細胞特異性,能夠反映分泌細胞的類型和病理生理條件。因此通過對外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,可以獲得有關(guān)來源細胞生理狀態(tài)的重要信息[14]。基于蛋白質(zhì)組學(xué)的外泌體研究可概括為如下流程(見圖1)[15]: (1)外泌體提取及表征;(2)基于高分辨質(zhì)譜的外泌體蛋白質(zhì)組鑒定;(3)利用生物信息學(xué)對外泌體蛋白質(zhì)組進行系統(tǒng)生物學(xué)分析。對于外泌體而言,尋找最佳的分離與表征方法是目前急需解決的關(guān)鍵問題。

2 外泌體的提取方法

如何高效、高純度地富集外泌體是實現(xiàn)其組學(xué)分析和功能研究的關(guān)鍵。然而外泌體體積小,密度低,加之在粒徑與組成方面存在異質(zhì)性,即使同種細胞產(chǎn)生的外泌體也有可能形態(tài)各異[16],給外泌體的提取帶來巨大困難。而不同的細胞來源的外泌體不僅大小和標志蛋白質(zhì)表達量存在差異[17,18],其密度也有所不同。例如B細胞的外泌體密度約為1.13 g/mL[19],上皮細胞外泌體密度約為1.19 g/mL[20]。另外,實際樣本中不僅存在大量高豐度雜質(zhì)蛋白質(zhì)的干擾,還有與外泌體具有相似生物物理學(xué)參數(shù)(表面化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)、尺寸、表面電荷、吸光度等)的其他類型囊泡,或某些疾病相關(guān)的免疫復(fù)合物和蛋白質(zhì)復(fù)合物。以上因素均可能嚴重影響外泌體的有效提取,給后續(xù)的組學(xué)分析和功能研究造成不可忽視的影響。

如今已發(fā)展了多種基于外泌體尺寸、密度及免疫表型的提取方法,包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、體積排阻色譜、免疫親和法等。

圖 1 基于高通量質(zhì)譜的外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略[15]Fig. 1 Overview of the methodological approaches in high-throughput mass spectrometry-based proteomic analyses of exosomes[15]

圖 2 常用的外泌體分離方法Fig. 2 Working principle of commonly used methods to isolate exosomes

2.1 超速離心法

超速離心法根據(jù)外泌體的密度及尺寸進行分離。該方法包括一系列離心過程:首先在300、2 000和10 000 g離心力作用下去除樣本中的細胞、細胞碎片和大囊泡,隨后在110 000 g條件下收集外泌體,最后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗沉淀以去除可溶的干擾蛋白質(zhì)(見圖2a)。在該方法中,外泌體的提取效率受離心力、樣本黏度、PBS清洗次數(shù)等因素的影響,高黏度樣本[21]、多次清洗[22]可能導(dǎo)致較低的外泌體回收率。超速離心法是目前外泌體分離的“金標準”,是目前使用最為廣泛的方法,其優(yōu)勢包括方法成熟、適用于大體積樣本。然而,該方法的缺點在于需要依賴昂貴的儀器,操作耗時費力,所得的外泌體易受蛋白質(zhì)聚合體和脂蛋白的干擾。

密度梯度離心法屬于一種更為嚴格的超速離心法,能夠根據(jù)樣品密度進一步純化囊泡,克服蛋白質(zhì)共沉淀造成的污染。常用的分離介質(zhì)包括碘克沙醇[23]和蔗糖[24]。以蔗糖為例,實際操作時,需要預(yù)先制備不同濃度梯度的蔗糖/D2O溶液,隨后加入待分離物質(zhì);在超速離心力的作用下,外泌體將在等密度區(qū)域(1.13～1.19 g/mL)駐留,收集該組分即可得純化的外泌體(見圖2b)。密度梯度離心法相較于傳統(tǒng)差速離心法提得的外泌體更純,但是操作更為繁瑣,離心耗時也更長。

2.2 體積排阻色譜

體積排阻色譜法以不同粒徑的聚合物凝膠填料作為分離介質(zhì),基于尺寸特征實現(xiàn)外泌體的分離。操作時,將樣本加入純化柱后用PBS洗脫,小分子可進入凝膠孔內(nèi)而大分子直接流出,因此小分子駐留時間更長(見圖2c)。通過收集適當時間的組分,即可得到純化的外泌體。目前已有多種商品化的外泌體純化柱,包括GE Healthcare的EVSecond純化柱和Izon的qEV系列試劑盒等。該方法的優(yōu)勢在于無需使用離心機,樣品以自然滴落的方式收集;所得的樣本純度高,可有效去除雜蛋白質(zhì)的干擾;方法重現(xiàn)性好[25]。但是純化柱對樣本的體積有嚴格限制,不適用于處理體積較大的樣品,而且洗脫液會稀釋樣本,導(dǎo)致最終產(chǎn)物濃度低[26]。

2.3 超濾法

超濾法是另一種常用的根據(jù)尺寸差異實現(xiàn)外泌體分離的方法,其原理與傳統(tǒng)的膜分離法相同。該方法通常選用相對分子截留量為100 kDa的超濾管,能夠在提取外泌體的同時濃縮樣本量,尤其適用于細胞培養(yǎng)液、尿液等大體積樣本[27](見圖2d)。相比于超速離心法,超濾法在低轉(zhuǎn)速下即可實現(xiàn)外泌體的分離,耗時短且不影響外泌體的生物活性。但是濾膜吸附的囊泡和蛋白質(zhì),不僅嚴重影響外泌體的提取效率,還可能堵塞濾孔,降低濾膜的壽命[28]。

2.4 親和法

親和提取法是目前特異性最好的一種外泌體提取方法,也是唯一一種能夠識別特定細胞來源的外泌體的方法。外泌體的親和提取主要通過抗體與外泌體膜蛋白質(zhì)之間的特異性相互作用實現(xiàn)(見圖2e)。所使用的抗體為單抗或多抗,目標蛋白質(zhì)可以是外泌體表面普遍具有的CD63、CD9、CD81等跨膜蛋白質(zhì)、膜聯(lián)蛋白質(zhì)和上皮細胞黏附分子(EpCAM)等[29,30],也可以是癌細胞外泌體表面獨有的標志性蛋白質(zhì)。例如,表面修飾A33(結(jié)腸上皮細胞特異性蛋白質(zhì))抗體的免疫磁珠能用于結(jié)腸癌細胞系LIM1215培養(yǎng)液中的結(jié)腸癌細胞外泌體的提取[31];單抗藥物赫賽汀(該類藥物屬于人源抗原癌基因人類表皮生長因子受體2 (HER2)單克隆抗體藥物,適用于HER2過度表達的轉(zhuǎn)移性乳腺癌)修飾的免疫磁珠不僅能夠提取HER2過度表達的乳腺癌細胞系培養(yǎng)液中的癌細胞外泌體,而且能夠捕獲惡性腹水中含有HER2的外泌體[32];利用anti-CD9抗體和抗前列腺特異性膜蛋白抗原(anti-PSMA)修飾的免疫磁珠,可以實現(xiàn)前列腺癌細胞培養(yǎng)液和前列腺癌患者血漿中前列腺癌細胞外泌體的特異性提取[33]。此外,也可以通過凝集素與外泌體表面糖蛋白之間的親和作用力實現(xiàn)外泌體的富集。這種方法常用于尿液,選擇性稍遜[34]。Nakai等[35]利用蛋白質(zhì)T淋巴細胞膜蛋白4 (Tim4)與外泌體表面磷脂酰絲氨酸之間的特異性親和作用力,建立了一種外泌體純化方法。由于Tim4和磷脂酰絲氨酸之間的結(jié)合依賴于Ca2+,因此通過添加鈣離子螯合劑EDTA即可釋放捕獲的囊泡,得到完整結(jié)構(gòu)的外泌體。然而,由于抗原抗體結(jié)合需要足夠的作用時間,親合法普遍存在操作耗時,提取效率低的缺點,不適用于大規(guī)模的分析。另外,外泌體生物活性易受洗脫液中極端pH和鹽濃度影響,不利于下游實驗[28]。

2.5 基于聚合物的共沉淀法

聚合物沉淀法是商業(yè)化外泌體提取試劑盒通常采用的策略,其中聚乙二醇是目前最常用的沉淀試劑。一般認為聚合物沉淀法的原理是聚合物通過“劫持”水分子,降低外泌體溶解度,進而在低速離心條件下發(fā)生沉降[5](見圖2f)。該方法通過常規(guī)離心即可實現(xiàn)分離,操作簡單,囊泡回收率高[36],然而提取的產(chǎn)物包含大量的脂蛋白和RNA復(fù)合物,純度極差,而且其中的聚合物難以去除,對下游分析產(chǎn)生不良影響[37]。

2.6 外泌體提取新方法

鑒于現(xiàn)有方法存在提取時間長、提取效率低、特異性不佳等不足,難以滿足科研需求,近年來科研工作者們發(fā)展了多種新型外泌體提取方法,以實現(xiàn)外泌體快速高效的富集。

圖 3 基于TiO2的外泌體富集原理示意圖Fig. 3 Mechanism of TiO2-based exosome isolation

其中一個重要的分支是以微流控為基礎(chǔ)實現(xiàn)外泌體的分離。基于微流控技術(shù)的外泌體分離檢測可概括為幾個主要類別,包括基于尺寸、表面帶電、免疫親和或流體技術(shù)等實現(xiàn)外泌體分離,具有所需樣本小、分離速率快、純度高等優(yōu)點。基于尺寸的外泌體分離裝置包括納米孔[38]、納米通道[39]、納米過濾器[40]和納米孔膜[41]等,使用此類裝置能夠有效避免雜蛋白質(zhì)和其他種類胞外囊泡的干擾,得到粒徑較為均一的外泌體。根據(jù)外泌體表面帶負電這一特性,研究人員設(shè)計了多種能夠通過靜電作用力捕獲外泌體的微流控裝置。Yasui等[42]將ZnO金屬絲固定于微流控基座,利用金屬絲表面正電性質(zhì)富集外泌體,而當在金屬絲表面涂覆中性Al2O3后,該裝置捕獲外泌體的能力受到嚴重影響。Heller等[43,44]設(shè)計了一種交流電微芯片裝置,能夠利用靜電作用力從血液中快速分離外泌體,隨后利用免疫熒光技術(shù)原位檢測所捕獲的外泌體,對疾病的早期診斷有極大幫助?；诿庖哂H和的微流控芯片技術(shù)具有極高的特異性,能夠從血樣中得到高純度的外泌體[45]。通過在芯片表面固載腫瘤外泌體特異性蛋白質(zhì)的抗體(表皮生長因子受體Ⅲ型突變體(EGFRvⅢ)、表皮生長因子受體(EGFR)、血小板源性生長因子受體(hPDGFR)、平足蛋白(Podoplanin)、內(nèi)皮細胞受體蛋白酪氨酸激酶A2(EphA2)和西妥昔單抗(Cetuximab)),甚至能夠從血液中捕獲并分析腫瘤特異性外泌體[46]。利用流體技術(shù)同樣能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的高效分離。例如Liu等[47]通過在介質(zhì)中添加少量生物兼容性聚合物控制作用于外泌體上的黏彈力,由此實現(xiàn)外泌體的分離。Wu等[48]建立了一種基于聲學(xué)流體(即聲學(xué)和微流體的整合)的分離方法,能夠以無標記和無接觸的方式從全血中直接分離外泌體,血細胞去除率超過99.999%?；谖⒘骺氐耐饷隗w分離技術(shù)在疾病診斷領(lǐng)域表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。

此外,利用外泌體膜的相關(guān)性質(zhì)也能實現(xiàn)外泌體的提取分離。例如利用外泌體膜表面帶負電這一特征,Heller課題組[43,44]借助靜電作用力將外泌體捕獲在帶正電的電極周圍。Wu等[49]建立了一種名稱為細胞外囊泡全面恢復(fù)和凈化(extracellular vesicles total recovery and purification, EVTRAP)的胞外囊泡富集方法,利用磁球表面的親水基團和親脂基團與外泌體膜表面脂質(zhì)分子之間獨特的親和力實現(xiàn)外泌體的富集。Wan等[50]建立了一種基于脂質(zhì)納米探針的外泌體富集方法,探針一端為脂質(zhì),能夠插入外泌體表面的磷脂雙分子層,另一端為生物素,能夠與磁球表面的鏈霉親和素特異性結(jié)合,從而實現(xiàn)血漿中外泌體的快速、高效提取。本實驗室從外泌體表面磷脂分子的結(jié)構(gòu)出發(fā),建立了一種全新的、基于TiO2和磷脂分子的磷酸基團之間特異性相互作用的外泌體提取方法(原理見圖3)[51]。該方法將外泌體的提取時間由傳統(tǒng)超離法的7～10 h縮短至5 min,同時模型外泌體的回收率可達93.4%,遠遠高于其他傳統(tǒng)方法。理論研究表明TiO2與外泌體之間存在有化學(xué)鍵參與的特異性相互作用,因此TiO2微球能夠?qū)崿F(xiàn)混合樣品和復(fù)雜實際樣本(血清)中外泌體的特異性富集。通過對胰腺癌患者血清外泌體與健康人血清外泌體的蛋白質(zhì)組研究,發(fā)現(xiàn)65種異常表達的蛋白質(zhì)(P<0.01, Log FC>2; FC: fold change),其中59種在胰腺癌患者中表達上調(diào),與包括胰腺癌在內(nèi)的多種癌癥密切相關(guān),證明該方法在基于外泌體的腫瘤標志物研究中具有重要應(yīng)用價值。

3 外泌體的表征手段

為獲得外泌體的大小、濃度、形態(tài)及蛋白質(zhì)組成等信息,可以通過電鏡、動態(tài)光散射、納米顆粒跟蹤分析儀、蛋白質(zhì)免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附法、流式細胞儀等對外泌體進行表征。

通過電鏡可獲得外泌體的形態(tài)信息,不同類型的顯微鏡由于操作環(huán)境不同,得到的外泌體形態(tài)存在差異。例如,在掃描電鏡、透射電鏡和原子力顯微鏡中,外泌體呈現(xiàn)囊泡獨有的茶托形[5],可能由于樣品在固定或染色過程中極度脫水,導(dǎo)致外泌體塌陷所致。與之相反,在冷凍電鏡中外泌體呈現(xiàn)圓形,由于不會脫水變性,所得的外泌體形態(tài)可能更加接近囊泡的真實狀態(tài)[52]。另外,由于透射電鏡和原子力顯微鏡具有較高分辨率,也能夠提供外泌體磷脂雙分子層厚度、粒徑分布等信息[53]。Knepper等[53]通過對透射電鏡得到的200個囊泡進行粒徑分析,結(jié)果表明尿液中外泌體的粒徑分布約為35～40 nm,磷脂雙分子層厚度約為直徑的1/5～1/10。透射電鏡結(jié)合免疫金標記法能夠得到外泌體表面特征分子的信息[54],有助于揭示外泌體的產(chǎn)生機制與來源。

動態(tài)光散射(dynamic light scattering, DLS)和納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)都是利用光學(xué)手段獲得囊泡粒徑分布的方法。兩者的不同之處在于動態(tài)光散射通過檢測散射光的強度計算得到顆粒粒徑,而納米顆粒跟蹤分析通過追蹤單個粒子的運動軌跡計算得到樣品濃度、粒徑分布等信息[5]。目前兩種方法都被廣泛應(yīng)用于外泌體顆粒數(shù)目和粒徑分布的測量,但兩種方法也各有不足。動態(tài)光散射法中散射光強度依賴于顆粒質(zhì)量(體積),混合體系中大囊泡的存在(即使只有很少的量)將嚴重影響測量結(jié)果,因此動態(tài)光散射法更適用于單分散體系。而且動態(tài)光散射法所得的結(jié)果強烈依賴于所應(yīng)用的數(shù)學(xué)算法。而采用納米顆粒跟蹤分析儀對不同粒徑范圍的囊泡進行檢測時,為了得到準確的濃度和粒徑信息,需要根據(jù)所要測量的顆粒粒徑范圍對儀器分別校準,操作繁瑣。受檢測靈敏度所限,納米顆粒跟蹤分析儀適用于粒徑范圍50 nm～1 μm的顆粒,粒徑小于50 nm的外泌體無法檢測[55]。除此之外,兩種方法都依賴光散射和粒子的布朗運動進行分析,難以區(qū)分合成的納米材料、大蛋白質(zhì)聚合體和生物囊泡[56]。

利用蛋白質(zhì)免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)可以對外泌體標志性蛋白質(zhì)進行定性定量分析。其中蛋白免疫印跡是外泌體的經(jīng)典表征手段之一,操作時往往需要細胞裂解液作為陰性對照。常用的外泌體標志性蛋白質(zhì)包括四跨膜蛋白質(zhì)CD63、CD81、CD9、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、水通道蛋白2(AQP2,尿液中)和凋亡誘導(dǎo)因子6相互作用蛋白(Alix)等[57],內(nèi)參蛋白質(zhì)可以是肌動蛋白(β-Actin)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH),陰性對照蛋白可以是阻抑素(PHB,線粒體標志蛋白)[58]或鈣聯(lián)結(jié)蛋白Calnexin[56]。在酶聯(lián)免疫吸附,析法中,外泌體裂解液通過固載有抗體的固相基質(zhì),隨后與檢測抗體共孵育。兩種方法均存在操作繁瑣、耗時長的問題,相比較而言,酶聯(lián)免疫吸附分析法比蛋白質(zhì)免疫印跡法更加快速,適用于高通量分析[5]。

流式細胞技術(shù)針對外泌體的表面抗原標記物進行檢測,能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的高通量、多通道分析。但由于外泌體粒徑小、折射率低,采用常規(guī)的流式細胞儀進行檢測時往往需要將外泌體與beads連接以增大表面積、增強反射,操作耗時費力[54]。Tian等[59]搭建了一種高靈敏度的流式細胞儀(HSFCM),將可檢測的外泌體粒徑降至40 nm,能夠在不連接beads的情況下實現(xiàn)每分鐘10 000個外泌體的檢測,并能夠結(jié)合免疫熒光的方法進行外泌體標志蛋白質(zhì)的定量檢測,目前該儀器已商品化。

總之,雖然目前幾種常用的表征方法尚有不足,但是多種方法結(jié)合能夠提高對外泌體的表征精度。隨著各項技術(shù)的發(fā)展,未來有望實現(xiàn)外泌體的準確、快速、可靠分析。

4 外泌體的生物學(xué)功能及其臨床應(yīng)用

4.1 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體最初被認為是細胞排出代謝廢物的一種方式,能夠幫助缺乏高效降解能力或位于排泄系統(tǒng)的細胞排出不必要的蛋白質(zhì)和RNA。近年來,隨著人們對外泌體的深入了解,外泌體的多種生物功能先后被發(fā)現(xiàn)。如今外泌體作為一種細胞間交流、傳遞大量的生物功能分子的重要方式日益受到重視。外泌體與受體細胞的信息交流可能通過以下4種途徑實現(xiàn)(見圖4)[8,60]: (1)外泌體表面膜蛋白質(zhì)被目的細胞表面的受體識別,從而激活靶細胞;(2)外泌體在蛋白酶作用下產(chǎn)生的表面膜蛋白質(zhì)碎片可作為目的細胞表面受體的配體;(3)外泌體脂膜可以與目的細胞膜融合,將蛋白質(zhì)和RNA等內(nèi)容物釋放進去,此類膜融合可能改變靶細胞的一些膜特性,例如脂質(zhì)和膜蛋白質(zhì)的密度及種類[61]; (4)目的細胞通過胞吞的形式攝入外泌體。

圖 4 外泌體參與細胞間信息交流的4種途徑Fig. 4 Four possible mechanisms of intercellular communication by exosomes

經(jīng)由以上幾種途徑,外泌體將其攜帶的生物信息運輸?shù)街苓叞屑毎蚪?jīng)血液等體液運輸而被遠處組織細胞攝取,進而影響目的細胞的基本功能和基因表達。幾乎所有的細胞都可以在自發(fā)或在一定刺激條件下產(chǎn)生外泌體,不同的細胞產(chǎn)生的外泌體具有不同的功能,這些外泌體參與了一系列生理和病理過程,如癌癥發(fā)生與發(fā)展、抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)、組織愈合等。

4.1.1正常細胞來源的外泌體

2007年,Valadi等[10]發(fā)現(xiàn)鼠源肥大細胞外泌體中的RNA可以轉(zhuǎn)移至其他小鼠或人肥大細胞,并在受體細胞中翻譯產(chǎn)生新的小鼠蛋白質(zhì),表明外泌體在細胞間mRNA和miRNA的傳遞中發(fā)揮重要作用,由此引起了人們對外泌體功能的極大關(guān)注。來自血細胞(包括血小板、白細胞和紅細胞)的外泌體具有參與凝血、提供促血管生成因子、誘導(dǎo)血管生成等生理功能;妊娠期外泌體能夠影響局部血管生成、調(diào)節(jié)分化、激活免疫、促進胚胎發(fā)育;肝臟細胞產(chǎn)生的外泌體有利于維護肝臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)[62]。由此可見,正常細胞產(chǎn)生的外泌體對維持機體的正常生命活動起重要作用。而腫瘤細胞、免疫細胞、干細胞等特殊來源的外泌體由于具有獨特的生物學(xué)功能,更加受到廣泛關(guān)注。

4.1.2腫瘤細胞來源的外泌體

與正常細胞相比,腫瘤細胞外泌體的分泌量增多,內(nèi)容物也存在明顯差異[63]。由于囊泡結(jié)構(gòu)的保護,腫瘤細胞來源的外泌體內(nèi)攜帶有大量腫瘤細胞來源的活性生物分子,其特點包括[64]: (1)提供具有穩(wěn)定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子;(2)保持蛋白質(zhì)的生物活性;(3)攜帶其中的生物分子經(jīng)體液運輸至遠端器官;(4)膜融合的作用方式使得腫瘤細胞來源的外泌體能夠與靶細胞之間進行更有效的信息交流。以上特征使腫瘤細胞來源的外泌體成為腫瘤細胞與外界信息交流的一種理想方式,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

外泌體介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移:體外研究和體內(nèi)成像實驗表明惡性腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體可以在全身水平上被同一腫瘤或遠端腫瘤中惡性程度較低的癌細胞攝入,其內(nèi)所包含的與轉(zhuǎn)移相關(guān)的mRNAs進入轉(zhuǎn)移性較低的細胞后,能夠增強其轉(zhuǎn)移能力[65]。外泌體介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移可能與多種作用機制相關(guān)。腫瘤細胞分泌的外泌體可以通過體液進入特定器官,建立有利于癌細胞生長的微環(huán)境,包括促進受體細胞上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、引發(fā)炎癥、促進血管生成,為癌細胞的擴散形成有利條件。Lyden課題組[66-68]針對外泌體介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移進行了一系列深入研究,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性黑素瘤細胞產(chǎn)生的外泌體所包含的miR-200家族能夠促進骨髓細胞的上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[68]。進一步研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞外泌體能夠引導(dǎo)癌癥轉(zhuǎn)移至特定器官,在膜表面特異性整合素的作用下,腫瘤細胞外泌體首先在特定的器官累積,引起受體器官產(chǎn)生炎癥、生成血管,形成有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境,使得腫瘤細胞更容易轉(zhuǎn)移至該器官[66,67]。Maji等[69]揭示了惡性腫瘤細胞外泌體中的Annexin Ⅱ蛋白能夠促進血管生成,為腫瘤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利的微環(huán)境。

外泌體介導(dǎo)腫瘤耐藥性:腫瘤細胞來源的外泌體中某些miRNAs和non-coding RNAs (lncRNA)的變化在腫瘤化療抗藥性的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Qu等[70]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可以通過競爭性結(jié)合miR-34/miR-449,促進晚期腎細胞癌細胞中的跨膜受體酪氨酸激酶anexelekto (AXL)和tyrosine-protein kinase Met (c-MET)表達,引發(fā)舒尼替尼耐藥。而外泌體能夠?qū)⑦@一lncRNA運輸至舒尼替尼敏感的癌細胞,從而傳播舒尼替尼的抗性。外泌體中的miR21能夠抑制卵巢癌細胞凋亡,并通過結(jié)合肌動蛋白絲相關(guān)蛋白凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor 1, APAF1)使得卵巢癌細胞產(chǎn)生對紫杉醇的抗藥性[71]?？拱┧幬锛魉麨I能夠引起胰腺導(dǎo)管腺癌細胞中miRNA-155表達上調(diào),上調(diào)的miRNA-155能夠促進外泌體分泌并以此為載體向其他胰腺導(dǎo)管癌細胞輸送miRNA-155,傳播對吉西他濱的抗藥性[72]。此外,多種外泌體來源的miRNAs可能與肺癌細胞對順鉑的耐藥性相關(guān)[73]。

外泌體介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸/免疫抑制:多項研究表明腫瘤細胞來源的外泌體能夠抑制免疫相關(guān)的信號通路、阻礙機體對腫瘤的免疫響應(yīng)。Chen等[74]研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細胞、乳腺癌和肺癌細胞會產(chǎn)生攜帶程序性死亡分子1的配體(programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1)的外泌體,此類外泌體在血液中循環(huán),通過表面PD-L1與T細胞結(jié)合,導(dǎo)致T細胞在到達腫瘤細胞之前即受到抑制,達到遠程干擾免疫細胞活性的效果。Chalmin等[75]則提出了腫瘤細胞來源的外泌體介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的另一種作用機制。他們的研究表明腫瘤來源的外泌體能夠抑制骨髓來源的抑制性細胞(該細胞是樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)、巨噬細胞和(或)粒細胞的前體,具有抑制免疫細胞應(yīng)答的能力)對腫瘤的免疫監(jiān)督。Wang等[76]發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞來源的外泌體與巨噬細胞共孵育后,其內(nèi)的miRNA-301a通過下調(diào)抑癌基因PTEN(phosphate and tension homo-logy deleted on chromsome ten),激活PI3Kγ(phosphoinositide 3-kinaseγ)信號分子,使巨噬細胞被“馴化”成為能參與抗炎反應(yīng)、血管生成以及促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移的M2型巨噬細胞。該研究證實了外泌體中miR-301a在腫瘤免疫逃逸以及轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用。

腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體除了具有上述參與腫瘤器官靶向轉(zhuǎn)移、促進受體細胞上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、引發(fā)炎癥、促進血管生成、改善腫瘤生長微環(huán)境、增強腫瘤耐藥性以及介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸等多種作用之外,還能夠增強腫瘤細胞對放療的耐受[77]、傳遞輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)[78](見圖5)。因此,對腫瘤細胞外泌體的分析和檢測對于腫瘤的早期診斷、預(yù)后分析和療效評價具有重要價值。

圖 5 腫瘤細胞來源的外泌體在癌癥發(fā)展過程中的作用[4]Fig. 5 Roles of tumor-derived exosomes in tumor progression[4]

4.1.3免疫細胞來源的外泌體

在免疫系統(tǒng)中,淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、肥大細胞等均可以產(chǎn)生外泌體。研究表明免疫細胞來源的外泌體能夠顯著影響機體的免疫調(diào)節(jié)機制,包括調(diào)節(jié)抗原呈遞、免疫激活、免疫監(jiān)督等。不同免疫細胞來源的外泌體功能不同,以樹突狀細胞(該細胞具有免疫刺激能力,是目前能夠激活初始T細胞的唯一抗原遞呈細胞)來源的外泌體為例,其外泌體的免疫刺激作用取決于來源細胞的成熟狀態(tài)。成熟的樹突狀細胞外泌體內(nèi)包含能夠直接激活T細胞的MHC class Ⅰ和MHC class Ⅱ,共刺激分子如CD40、CD8、CD86和熱激蛋白,這些分子使樹突狀細胞來源的外泌體具有抗原呈遞、調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的生物功能[79]。Zitvogel等[80]經(jīng)體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn),小鼠骨髓樹突狀細胞產(chǎn)生的外泌體中含有的腫瘤多肽能夠啟動特異性細胞毒性T淋巴細胞,根除或抑制小鼠腫瘤的生長,這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤免疫治療提供了新的研究思路。另外,樹突狀細胞來源的外泌體也能夠通過激活其他免疫細胞誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng),從而抑制腫瘤[81]。

B細胞分泌的外泌體同樣包含MHC Ⅱ-多肽復(fù)合物,能夠激活人和小鼠抗原特異性T細胞,從而實現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的功能[36]。細菌或病原體感染的巨噬細胞外泌體能夠刺激巨噬細胞和中性粒細胞分泌炎性介質(zhì),在增強機體免疫監(jiān)督方面發(fā)揮重要作用[82]。肥大細胞來源的外泌體也能夠參與機體免疫響應(yīng),包括促進B細胞和T細胞增殖,刺激產(chǎn)生細胞因子以及引發(fā)樹突狀細胞表型和功能成熟[83]。CD4+T細胞產(chǎn)生的外泌體同樣具有免疫調(diào)節(jié)的作用[84]。

4.1.4干細胞來源的外泌體

由于外泌體能夠反映其來源細胞的特性,不同干細胞來源的外泌體表現(xiàn)的生物功能也不盡相同,其中最受人們關(guān)注的一類干細胞外泌體來源于間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞存在于骨髓、脂肪、臍血、牙髓、滑膜液等部位,是一種能夠自我更新的多功能干細胞。由于具有多向分化、促進組織修復(fù)、抗炎、免疫抑制和保護神經(jīng)等功能,間充質(zhì)干細胞在細胞治療領(lǐng)域有著獨特的優(yōu)勢。大量研究工作表明,間充質(zhì)干細胞通過旁分泌的形式發(fā)揮其生理功能,而外泌體作為一種細胞間傳遞信息的介質(zhì),在間充質(zhì)干細胞的功能行使中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能夠修復(fù)組織損傷[85]、抑制腫瘤生長[86]和調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)[87],具有治療心肌梗死、自身免疫疾病、阿爾茲海默癥等疾病的潛力。

另外,也有研究[88]顯示間充質(zhì)干細胞來源的外泌體會促進某些腫瘤生長。但是由于外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)方面的復(fù)雜性,加之干細胞具有多向分化的能力,干細胞來源外泌體的詳細功能有待進一步挖掘,其作用機制也有待深入探究。

4.2 外泌體在疾病診斷中的應(yīng)用

外泌體作為疾病診斷的標志物具有其獨特優(yōu)勢:(1)與正常細胞相比,病變細胞產(chǎn)生的外泌體在分泌量和內(nèi)容物方面存在明顯差異。病變的細胞和組織能夠產(chǎn)生更多外泌體[89],例如,癌癥患者血液中外泌體的含量更高[54]。外泌體包含來源細胞多種特異性生物分子(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸),這類特異分子有利于識別體液中外泌體的細胞來源。(2)由于特殊的生成方式,外泌體的組成不同于來源細胞。其內(nèi)包含的一些特異性蛋白質(zhì)能夠揭示外泌體的起源、結(jié)構(gòu)和運輸方式,有利于深入了解外泌體的產(chǎn)生機制。另外,一些在細胞裂解液中難以檢測到的、具有重要生物意義的低豐度蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì),在外泌體中豐度較高[90]。(3)病變細胞分泌的外泌體通過胞吐的過程進入血液、尿液等體液,囊泡狀結(jié)構(gòu)能夠保護外泌體內(nèi)部生物分子不受體液中蛋白酶、磷酸酶、核酸酶等干擾,有利于保持其結(jié)構(gòu)完整和生物活性,通過對此類體液進行分析可以實現(xiàn)疾病的無創(chuàng)或微創(chuàng)檢測。

血清和血漿為常規(guī)檢測樣本,具有微創(chuàng)取樣的優(yōu)點,是診斷疾病的理想樣本。血液中外泌體能夠作為胰腺癌[54]、胃癌[91]、肺癌[92]和阿爾茲海默[93]等疾病的早期診斷和療效評價提供潛在標志物。血液外泌體來源的疾病標志物主要包括蛋白質(zhì)和miRNA兩類。Melo等[54]發(fā)現(xiàn)利用胰腺癌細胞外泌體表面的磷脂酰肌醇聚糖-1(GPC1)能夠?qū)崿F(xiàn)胰腺癌早期診斷,利用該方法對血清中包含GPC1的外泌體進行檢測,能夠高特異性(100%)、高靈敏度(100%)地區(qū)分胰腺癌患者(246例)和正常人(20例)以及慢性胰腺炎患者(37例)。Taylor等[94]的研究結(jié)果顯示卵巢癌患者與良性卵巢疾病患者血清外泌體中的miRNA表達譜有明顯差異,表明血清外泌體中的miRNA可以作為卵巢癌活檢的替代診斷標志物。多項研究[95-97]表明外泌體中的miR-21在包括大多數(shù)癌癥的多種病理條件下過度表達。

尿液外泌體來源于泌尿系統(tǒng)相關(guān)的各種細胞,包括腎小球足細胞、腎小管細胞和膀胱等,因此尿液外泌體數(shù)目、形態(tài)和生化性質(zhì)的改變往往反映泌尿系統(tǒng)疾病。Widmark等[98]通過對前列腺癌癥患者尿液中的外泌體進行轉(zhuǎn)錄組分析,鑒定到兩種已知的前列腺癌癥標志物PCA-3 (prostate cancer antigen 3,前列腺癌抗原3)和TMPRSS2: ERG (the fusion gene of transmembrane protease serines to ERG,跨膜蛋白酶絲氨酸與ERG的融合基因),表明尿液外泌體具有診斷和監(jiān)測癌癥患者狀態(tài)的潛力。除已知的疾病標志物,Rodríguez等[99]通過對28例前列腺癌癥患者和19例正常人尿液外泌體中的miRNA進行深度測序分析,發(fā)現(xiàn)兩種miRNA(miR-196a-5p和miR-501-3p)在前列腺癌患者組明顯下調(diào),表明尿液外泌體中的特異性miRNA可能作為前列腺癌的新型生物標志物。Khurana等[100]將研究對象由miRNAs擴大至多種類型RNA,通過對慢性腎病患者尿液外泌體中各類RNA進行系統(tǒng)研究,在慢性腎病患者組中識別出30種顯著差異的lncRNAs,表明尿液外泌體中的lncRNAs具有作為慢性腎病早期診斷標志物的潛力。Skotland等[101]的研究則表明尿液外泌體中的脂質(zhì)能夠作為前列腺癌的新型標志物,3種脂質(zhì)標志物結(jié)合使用能夠有效提高對前列腺癌的診斷靈敏度(93%)和特異性(100%)。

除血液和尿液外,其他體液中包含的病變細胞來源的外泌體也有可能成為疾病的重要標志物。唾液中包含來自于唾液腺上皮體外細胞的外泌體,Michael等[102]從唾液中提取外泌體,并對唾液外泌體中的miRNA進行分析,發(fā)現(xiàn)此類miRNA有望作為成為唾液腺疾病的生物標志物。Wu等[103]成功從汗液中提取得到外泌體,并進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,在汗液外泌體中共鑒定到1 062種蛋白質(zhì),其中包含多種抗菌肽和免疫因子,表明汗液外泌體參與皮膚免疫。Liu等[104]從患有阿爾茲海默癥患小鼠的腦脊髓液中提取得到外泌體,并與野生型小鼠進行對比,發(fā)現(xiàn)實驗組miR-193b顯著下調(diào),該結(jié)果與血液外泌體結(jié)果一致。

由此可見,外泌體來源的內(nèi)容物可作為多種疾病的潛在標志物,為臨床診斷提供有用信息。通過對體液中外泌體進行檢測,更是能夠以無創(chuàng)或微創(chuàng)的方式實現(xiàn)疾病診斷,具有良好的應(yīng)用前景。

4.3 外泌體在疾病治療中的應(yīng)用

4.3.1外泌體用于癌癥免疫治療

基于免疫細胞來源的外泌體能夠介導(dǎo)和調(diào)節(jié)機體對腫瘤的免疫反應(yīng),外泌體在腫瘤免疫治療方面的潛力受到廣泛關(guān)注。其中樹枝狀細胞產(chǎn)生的外泌體包含大量的MHC-多肽復(fù)合物和免疫刺激相關(guān)的分子,能夠激活相關(guān)的T細胞,介導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤應(yīng)答,在多個臨床試驗中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤療效[105]。Morse等[105]考察了樹枝狀細胞外泌體對非小細胞肺癌患者的療效。結(jié)果表明,患者對樹枝狀細胞外泌體耐受性良好,1/3患者表現(xiàn)出了對樹枝狀細胞外泌體的T細胞響應(yīng),2/4患者自然殺傷細胞活性得以激活。Escudier等[106]公布了利用自體樹突狀細胞外泌體免疫治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的臨床一期試驗結(jié)果,發(fā)現(xiàn)自體樹突狀細胞外泌體無明顯毒性,并且具有刺激自然殺傷細胞的能力。以上臨床試驗證明了外泌體免疫療法的安全性和可行性,為進一步臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

4.3.2外泌體作為藥物載體

由于特殊的結(jié)構(gòu)和循環(huán)方式,外泌體作為藥物運輸?shù)妮d體具有獨特的優(yōu)勢。例如外泌體的尺寸分布能夠增強滲透滯留效應(yīng),從而有選擇性地深入腫瘤組織;其外層磷脂雙分子層可以保護內(nèi)容物不受各種生物酶的影響,維持各種生物分子的活性;外泌體普遍存在于各種體液和組織中,其體積小,結(jié)構(gòu)、組成與細胞膜類似,導(dǎo)致外泌體可以在避開免疫系統(tǒng)監(jiān)督的同時深入組織內(nèi)部,有較好的生物相容性;當采用內(nèi)源外泌體時,能明顯降低其他藥物載體可能引起的有害免疫反應(yīng);除此之外,某些細胞來源或經(jīng)特殊修飾過的外泌體具有良好的特異性,可以與特定的器官或組織結(jié)合[107]。因此,載藥成為外泌體研究的一個重要分支,具有良好的應(yīng)用前景。

在外泌體中引入藥物的方式包括體內(nèi)裝載和體外裝載兩種。體內(nèi)藥物裝載可以通過傳統(tǒng)方法(如病毒轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔等)轉(zhuǎn)染來源細胞,編碼感興趣的RNA或蛋白質(zhì),也可以使藥物與來源細胞共混,使細胞分泌產(chǎn)生含有目標生物分子的外泌體。體外藥物裝載則首先需要得到純化的外泌體,然后將感興趣的藥物通過電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法裝入純化的外泌體。外泌體內(nèi)可裝載的藥物包括小分子化學(xué)藥物[108,109]、蛋白質(zhì)和多肽[110]、核酸藥物[111]、天然產(chǎn)物[112]等。

Pascucci等[108]將包含有紫杉醇的間充質(zhì)細胞來源外泌體與胰腺癌細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)裝載紫杉醇的間充質(zhì)細胞外泌體具有很強的抗腫瘤增殖效果。Tian等[109]為降低免疫原性與毒性,采用小鼠未成熟樹突狀細胞所產(chǎn)生外泌體作為藥物載體。同時為實現(xiàn)外泌體運輸?shù)陌邢蛐?使細胞表達能夠識別乳腺癌細胞的外泌體膜蛋白Lamp2b (lysosomeassociated membrane glycoprotein 2b,溶酶體相關(guān)膜蛋白2)。并采用電穿孔的方法,在純化所得的小鼠未成熟樹突狀細胞外泌體中載入阿霉素。結(jié)果表明該外泌體能夠特異性的將阿霉素傳遞給腫瘤組織,抑制腫瘤生長且無明顯毒性。Haney等[110]將用于治療帕金森氏綜合征的過氧化氫酶包入外泌體,能夠明顯提高藥物載入的效率,維持藥物的持續(xù)釋放,具有顯著的神經(jīng)保護作用。研究表明多種miRNA(例如miR-124)有助于修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷,然而由于核酸易于降解,加之大部分小分子難以通過血腦屏障,使得核酸藥物難以發(fā)揮作用。Yang等[111]利用外泌體能夠通過血腦屏障這一天然優(yōu)勢,并進一步將狂犬病病毒糖蛋白與外泌體溶酶體相關(guān)的膜蛋白融合,經(jīng)改造后的外泌體能夠靶向地將miR-124運輸至腦梗部位,對修復(fù)缺血性損傷神經(jīng)有顯著效果。Zhuang等[112]通過自組裝的方法將姜黃素裝入外泌體中,用于增強藥物的抗炎性。外泌體不僅能夠增加疏水性天然藥物的溶解度、穩(wěn)定性和生物利用度,也能夠提高姜黃素的傳輸效率。由此可見,外泌體作為一種新型的藥物載體具有廣泛的應(yīng)用前景。

如今,伴隨對外泌體分泌機制、功能的深入了解,人們意識到外泌體作為細胞間通訊的重要介質(zhì),不僅參與生物體內(nèi)正常的生理功能,還涉及某些疾病的發(fā)病機理,包括腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等。外泌體被認為是疾病的生物標志物和預(yù)后因子,加之能夠作為基因和藥物遞送的載體,具有重要的臨床診斷和治療意義。

5 展望

外泌體作為細胞間信息交流的重要介質(zhì),既對維持機體的正常生命活動起重要作用,也在腫瘤、免疫、組織修復(fù)等領(lǐng)域發(fā)揮獨特的生物學(xué)功能,因而受到廣泛關(guān)注。隨著研究的不斷深入,外泌體的各項功能逐漸被挖掘,越來越多的分離提取技術(shù)不斷涌現(xiàn)。但目前依然存在著一些重大問題與挑戰(zhàn),例如不同細胞來源外泌體在機體內(nèi)的作用機制尚不明確;尚無一種方法能夠同時實現(xiàn)外泌體快速、高效、高純度、無損傷的提取,難以滿足目前科研和臨床的需求。雖然如此,隨著分離和檢測技術(shù)的不斷開發(fā)、融合,外泌體在不同領(lǐng)域的諸多潛能終將會被發(fā)掘。