繆亞娜， 熊文典， 萬(wàn)愛(ài)妮， 張晶晶， 蔡燕飛， 陳 蘊(yùn)， 金 堅(jiān)*

(1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

白介素是一種由人白細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞因子[1]。近20年，IL2在治療腫瘤、黑色素瘤、腎炎[2]、肝炎以及免疫缺陷性疾病[3]中取得顯著效果。但由于IL2相對(duì)分子質(zhì)量小，體內(nèi)半衰期短[4]以及具有一定的免疫源性甚至?xí)疬^(guò)敏反應(yīng)等因素，IL2的藥物利用率低，患者需頻繁注射，限制了IL2的應(yīng)用。HSA融合技術(shù)實(shí)現(xiàn)了各種人源藥物蛋白質(zhì)分子與HSA蛋白質(zhì)的融合表達(dá)[5-6]。雷建勇等[7]構(gòu)建pPIC9K-HAS/IL2質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)入畢赤酵母，純化得到HAS/IL2融合蛋白不僅蛋白活性好，而且有效延長(zhǎng)蛋白質(zhì)半衰期至12.34 h。后期研究中發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母表達(dá)HSA融合蛋白時(shí)存在蛋白質(zhì)降解、產(chǎn)物不均一和過(guò)度糖基化等現(xiàn)象，這些不利因素限制了畢赤酵母表達(dá)IL-2融合蛋白的應(yīng)用。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 （Chinese hamster ovary cells，CHO Cells）不僅具有重組基因高效表達(dá)能力，而且可精確轉(zhuǎn)錄翻譯、折疊蛋白質(zhì)，并能保證蛋白質(zhì)的充分糖基化[8]，成為重組糖基化蛋白生產(chǎn)的首選體系。盧慧惠等[9]構(gòu)建pMH3-HAS-IL2質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞，篩選出表達(dá)HSA/IL2的CHO細(xì)胞株，經(jīng)搖瓶流加培養(yǎng)及純化獲得活性較好的HSA/IL2融合蛋白，解決了融合蛋白的降解和糖基化等問(wèn)題。但CHO細(xì)胞培養(yǎng)仍有問(wèn)題急需解決，如細(xì)胞生長(zhǎng)密度低（最高生長(zhǎng)密度僅為6.0×106cells/mL）、HSA/IL2表達(dá)量低（僅為53 mg/L）等。

懸浮培養(yǎng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究和應(yīng)用的重要模式和首要選擇[10]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)基通常按一定比例加入血清或者組織提取物，然而細(xì)胞只能在無(wú)血清或含血清替代物的培養(yǎng)基中才能實(shí)現(xiàn)懸浮狀態(tài)。隨著對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的深入和藥品安全性標(biāo)準(zhǔn)的提高，基于細(xì)胞和產(chǎn)品特性的無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)的研究受到關(guān)注[11]。目前，雖然無(wú)血清培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)取得一定的成果，但因細(xì)胞株的個(gè)性化問(wèn)題，商業(yè)化的無(wú)血清培養(yǎng)基仍不能滿足特定細(xì)胞株的高密度生長(zhǎng)和產(chǎn)物高表達(dá)需求。因而，優(yōu)化適合特定細(xì)胞株生長(zhǎng)和表達(dá)的低成本無(wú)血清培養(yǎng)基成為細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵問(wèn)題之一。蛋白質(zhì)水解物不僅含有多肽物質(zhì)，而且含有氨基酸、糖類、脂類、礦物質(zhì)和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、凋亡及產(chǎn)物表達(dá)等生命活動(dòng)產(chǎn)生特殊的調(diào)控作用。培養(yǎng)基中添加蛋白質(zhì)水解物還是一種快捷而有效的培養(yǎng)基優(yōu)化方法，可快速獲得較好的培養(yǎng)基配方，顯著縮短培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)間，降低優(yōu)化成本，因而被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域

本文中評(píng)估了3種蛋白質(zhì)水解物，分別為：胰蛋白胨 （動(dòng)物水解物）、酵母提取物 （微生物水解物）、大豆蛋白胨（植物水解物），作為培養(yǎng)基添加劑對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活率、目的蛋白HSA/IL2表達(dá)、細(xì)胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

表達(dá)HSA-IL2融合蛋白的CHO-S細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.2 主要試劑

酵母提取物（YE）、大豆蛋白胨（Soytone）及胰蛋白胨（Tyrtone），均購(gòu)自上海生工生物有限公司；M1為無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基、M1及補(bǔ)料培養(yǎng)基Feed 3，均購(gòu)自蘇州康聚生物有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

分批培養(yǎng)：將細(xì)胞以2×106cells/mL的密度接種于150 mL搖瓶，培養(yǎng)體積30 mL，置于37℃、100 r/min的搖床中培養(yǎng)。

流加培養(yǎng)：將細(xì)胞以2×106cells/mL的密度接種于250 mL搖瓶，培養(yǎng)體積50 mL。細(xì)胞培養(yǎng)至第3天時(shí)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基Feed 3，并維持葡萄糖質(zhì)量濃度為2~3 g/L。第4天，培養(yǎng)溫度降至34℃，細(xì)胞活率在80%時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。

1.4 分析方法

1.4.1 細(xì)胞密度及活力的檢測(cè) 細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀，美國(guó)Nexcelom Cellometer公司產(chǎn)品，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法，測(cè)定細(xì)胞密度及活率并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)及活率曲線。

1.4.2 融合蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定 尿微量白蛋白測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海名典生物有限公司。

1.4.3 細(xì)胞周期測(cè)定 取5×105個(gè)活細(xì)胞，4℃、1000 r/min離心5 min，棄上清液。PBS洗滌2次，加入1 mL冰乙醇，-20℃冰箱保存過(guò)夜。離心收集細(xì)胞，加入溴化乙錠（PI），使用流式分析儀進(jìn)行分析。流式分析儀，購(gòu)自BD公司。

1.4.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定 FITC Annexin V凋亡測(cè)定試劑盒，購(gòu)自BD公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.4.5 滲透壓測(cè)定 滲透壓測(cè)定儀，購(gòu)于天津天河儀器有限公司，測(cè)定培養(yǎng)基滲透壓。

1.4.6 氨基酸分離測(cè)定 Agilent-1260型高效液相儀分析氨基酸種類濃度；柱型：Venusil AA，5 um，4.6×250 mm。18種常見(jiàn)氨基酸標(biāo)品，購(gòu)自美國(guó)Wako公司。

2 結(jié)果與討論

2.1 分批培養(yǎng)篩選最優(yōu)水解物質(zhì)量濃度

不同種類及不同質(zhì)量濃度的水解物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)物表達(dá)有較大影響[13]。為了研究不同水解物對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)及HSA/IL2表達(dá)的影響，以M1為對(duì)照組（0 g/L 組），3 種水解物（Soy、Tyr、YE）及其不同終質(zhì)量濃度（1.0、2.5、5.0、10.0 g/L）為實(shí)驗(yàn)組。 結(jié)果顯示，與0 g/L組相比，3種水解物均可提高細(xì)胞密度；Soy組和低質(zhì)量濃度 YE、Tyr組 （1.0、2.5 g/L）提高細(xì)胞密度（圖 1（a））和 HSA/IL2表達(dá)量（圖 1（b））作用不明顯；高質(zhì)量濃度 YE、Tyr組（5.0、10.0 g/L）提高細(xì)胞密度和HSA/IL2表達(dá)量作用明顯且結(jié)果相近；5.0 g/L YE組提高HSA/IL2表達(dá)量作用最好。

圖1 不同水解物及其質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞密度及目的蛋白表達(dá)量影響Fig.1 Effects of hydrolysate concentration on cell density and HSA/IL2 production

為了對(duì)比不同水解物及其不同質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞密度和HSA/IL2表達(dá)量的作用差異，以Cmax/C0（添加不同質(zhì)量濃度水解物組最高細(xì)胞密度與對(duì)照組最高細(xì)胞密度比值）和Mmax/M0（添加不同質(zhì)量濃度水解物組最高目的蛋白表達(dá)量與對(duì)照組最高目的蛋白表達(dá)量比值）為指標(biāo)，比值越大，提高細(xì)胞密度或HSA/IL2表達(dá)量作用越明顯，以此確定水解物最優(yōu)質(zhì)量濃度。

表 1 YE 組 Cmax/C0、Mmax/M0比值Table 1 Cmax/C0、Mmax/M0of YE group

如表1所示 （YE組為例），5.0 g/L組的Cmax/C0及Mmax/M0最大，分別為1.4和2.15，說(shuō)明5.0 g/L YE提高細(xì)胞密度和HSA/IL2表達(dá)量作用最明顯。因此選擇5.0 g/L YE為最優(yōu)添加質(zhì)量濃度，并進(jìn)行流加培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。（Tyr和Soy組最優(yōu)水解物質(zhì)量濃度均為5.0 g/L）

2.2 流加培養(yǎng)過(guò)程中水解物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及目的蛋白表達(dá)的影響

流加培養(yǎng)是以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，依據(jù)細(xì)胞代謝情況補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基。流加培養(yǎng)一方面可以有效解決營(yíng)養(yǎng)限制和毒副產(chǎn)物積累問(wèn)題，另一方面可以延長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)及表達(dá)目的蛋白時(shí)間[14]。范里等[15]采用兩階段動(dòng)態(tài)流加培養(yǎng)方式大幅度延長(zhǎng)細(xì)胞合成抗體融合蛋白的維持時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。本研究室前期通過(guò)優(yōu)化溫度條件，確定了1.3節(jié)中流加培養(yǎng)方式并取得較好結(jié)果。因此，采用該流加培養(yǎng)方式進(jìn)一步研究3種蛋白質(zhì)水解物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及HSA/IL2表達(dá)的作用。以M1為對(duì)照組（Control組），5.0 g/L的 YE、Tyr、Soy為實(shí)驗(yàn)組。 如圖 2（a）所示，Soy 組細(xì)胞密度及活率略高于Control組，培養(yǎng)時(shí)間為9 d；YE組、Tyr組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為11 d，YE組、Tyr組細(xì)胞密度和活率變化趨勢(shì)相近；第4天開(kāi)始，YE組、Tyr組細(xì)胞密度高于 Control組、Soy 組；4~11 d，YE組、Tyr組細(xì)胞密度及活率持續(xù)高于Control組、Soy組。結(jié)果表明，含5.0 g/L YE或 Tyr的M1培養(yǎng)基，提高細(xì)胞密度及活率作用明顯，并且能夠延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。

圖2 流加培養(yǎng)時(shí)不同水解物對(duì)細(xì)胞密度及HSA/IL2表達(dá)量影響Fig.2 Fed-batch culture using M1supplemented with 5 g/L of different hydrolasates

如圖 2（b）所示，與 Control組相比，YE 組 HSA/IL2表達(dá)量最高，其次為Tyr組；Soy組HSA/IL2表達(dá)量略高于Control組。以上結(jié)果表明：培養(yǎng)基M1中添加 3 種水解物（YE、Tyr、Soy）時(shí)，YE 提高細(xì)胞密度、活率和HSA/IL2表達(dá)量作用最明顯。

不同的蛋白質(zhì)水解物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)物作用差異顯著，趙麗麗等[16]將不同水解物進(jìn)行混合，細(xì)胞生長(zhǎng)密度和目的產(chǎn)物增加顯著。本研究中將3種水解物按一定比例混合后，細(xì)胞密度和HAS/IL2表達(dá)量未出現(xiàn)顯著提高。由此說(shuō)明，優(yōu)化培養(yǎng)基時(shí)不僅需要篩選合適的添加組分，而且需要均衡營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2.3 酵母提取物YE促進(jìn)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)及HSA/IL2表達(dá)機(jī)理的初步探究

為了探究蛋白質(zhì)水解物YE促進(jìn)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)和HSA/IL2表達(dá)的原因，對(duì)培養(yǎng)基滲透壓、YE中氨基酸種類、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.1 滲透壓影響 研究報(bào)道[17-18]蛋白質(zhì)水解物的滲透壓、剪切力保護(hù)劑作用及抗凋亡的特性可改善細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，因此對(duì)含不同水解物的培養(yǎng)基滲透壓進(jìn)行檢測(cè)并分析（表2）。

表2 含不同水解物的培養(yǎng)基滲透壓值Table 2 Osmolalities of M1 medium supplemented with different hydrolysates

表2所示，添加3種蛋白質(zhì)水解物均增加M1培養(yǎng)基滲透壓；含YE的培養(yǎng)基滲透壓增加明顯，為341 mOsmol/kg，高出M1培養(yǎng)基25 mOsmol/kg。然而，Sung等[19]以NaCl為對(duì)照組，同等滲透壓時(shí)細(xì)胞表達(dá)蛋白產(chǎn)量增加，但促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用不明顯。由此推斷，添加YE雖然可以改變培養(yǎng)基的滲透壓環(huán)境，對(duì)HSA/IL2表達(dá)也有影響但非主要原因。

2.3.2 氨基酸影響 蛋白質(zhì)水解物含有豐富肽類物質(zhì)，其中氨基酸不僅用于細(xì)胞合成蛋白質(zhì)、核酸和酯類等物質(zhì)，同時(shí)也用于代謝產(chǎn)生能量。不同種類的水解物因來(lái)源不同，其氨基酸組成可能存在差異。本研究中利用高效液相分離技術(shù)，測(cè)定了3種蛋白質(zhì)水解物中游離氨基酸的種類和相對(duì)含量。結(jié)果表明：Tyr和Soy中氨基酸種類少，YE中氨基酸種類最多，除共有的幾種氨基酸外（L-Cys、L-Ile、LPhe），還包括相對(duì)含量較高的氨基酸有：L-Asp、LArg、L-Thr、L-Lys等。 相比 Tyr和 Soy，YE 含豐富氨基酸可能是其促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及表達(dá)HSA/IL2作用最明顯的原因之一。Franek F等［17-18］認(rèn)為蛋白水解物不僅為動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)提供氨基酸，還是特殊活性肽段的重要來(lái)源，這些肽段具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞活力、增加產(chǎn)物表達(dá)等功能。YE中可能也存在某類活性肽段發(fā)揮重要作用，需要進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。

2.3.3 YE對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的影響 蛋白質(zhì)水解物會(huì)影響細(xì)胞周期分布，影響細(xì)胞增殖[20]。為了研究不同培養(yǎng)時(shí)期，YE對(duì)細(xì)胞周期分布的影響，選擇第2天（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）、第5天（表達(dá)期）的細(xì)胞做細(xì)胞周期分析，以M1培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組，分別標(biāo)記為Control-1、Control-2組；含5.0 g/L YE的M1培養(yǎng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組（YE組），分別標(biāo)記為YE-1、YE-2。

圖3 YE對(duì)不同時(shí)期細(xì)胞的周期分布影響Fig.3 Effects of YE on cell cycle in different periods

表3 YE作用下細(xì)胞周期分布情況Table 3 Phases of cell cycle with YE

如表 3所示：Control-1、YE-12組細(xì)胞 G1期比例無(wú)明顯差異，分別為46.55%和47.4%，但YE-1組細(xì)胞S期比例明顯高于Control-1組，由Control-1組的20.48%提高至30.33%。此結(jié)果表明，細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，5.0 g/L YE可以提高細(xì)胞S期比例而幾乎不影響細(xì)胞G1期比例，利于細(xì)胞生長(zhǎng)；在YE組中，YE-2細(xì)胞G1期比例明顯高于Control-2組，由Control-2組的58.12%提高至76.16%。此結(jié)果表明，細(xì)胞表達(dá)期時(shí)，M1培養(yǎng)基含5.0 g/L的YE時(shí)可以明顯提高細(xì)胞G1期比例而幾乎不影響細(xì)胞S期比例，延長(zhǎng)細(xì)胞表達(dá)期時(shí)間，利于細(xì)胞表達(dá)HSA/IL2。

隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡或壞死比例隨之增高。蛋白質(zhì)水解物可以抑制細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[21]。為了探究YE對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，選擇第5天細(xì)胞，以M1培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組（Control），含5.0 g/L YE的M1培養(yǎng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組（YE組）。

圖4為YE對(duì)細(xì)胞凋亡影響圖，如圖所示，Control組細(xì)胞凋亡率為19.17%，YE組細(xì)胞凋亡率為13.18%，比Control組降低了5.99%。此外，YE組正常細(xì)胞比率（Q4）明顯高于Control組，由79.65提高至86.0%，與圖2（a）中細(xì)胞高活率結(jié)果一致。結(jié)果表明，M1培養(yǎng)基含5.0 g/L的YE時(shí)不僅可以提高細(xì)胞活率，而且可以降低細(xì)胞凋亡率，延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。

圖4 YE對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of YE on cell apoptosis

3 結(jié)語(yǔ)

許多研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)水解物可以促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體、重組蛋白等生物制品[11]，降低細(xì)胞培養(yǎng)的成本，利于動(dòng)物細(xì)胞工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)水解物在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、抗體及單克隆抗體生產(chǎn)、疫苗制備等生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文中研究了 3 種水解物 （Tyr、Soy、YE）對(duì)CHO細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、目的蛋白HSA/IL2表達(dá)、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明：（1）M1培養(yǎng)基中含不同質(zhì)量濃度（1.0、2.5、5.0、10.0 g/L）的蛋白質(zhì)水解物時(shí)，5.0 g/L 蛋白水解物（YE、Soy、Tyr）促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及表達(dá)HSA/IL2作用明顯；（2）在3種水解物（YE、Soy、Tyr）中，5.0 g/L 的 YE 提高細(xì)胞密度、活率及表達(dá)HSA/IL2作用最明顯；（3）YE促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及HSA/IL2表達(dá)作用明顯的原因可能是它含有豐富的氨基酸種類，并且可以提高培養(yǎng)基滲透壓；（4）細(xì)胞生長(zhǎng)期時(shí)，YE可以提高細(xì)胞S期比例而有利于細(xì)胞生長(zhǎng)；細(xì)胞表達(dá)期時(shí)，YE可以提高細(xì)胞G1期比例而有利于細(xì)胞表達(dá)HSA/IL2；（5）YE不僅可以提高細(xì)胞活率，而且可以降低細(xì)胞凋亡率，延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。本研究為蛋白質(zhì)水解物在培養(yǎng)基優(yōu)化中的應(yīng)用提供了參考。