張玉潔 ， 孫曉紅 *， 周彤彤 ， 趙 勇 ， 吳啟華 ， 潘迎捷

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（上海），上海 201306；3.美國USDA-ARS研究中心，美國加利福尼亞州 94710）

副溶血性弧菌是我國引起食物中毒的重要致病菌之一，人們食用生的、未完全煮熟或操作不當(dāng)引起的副溶血性弧菌污染的水產(chǎn)品可引起腹瀉、嘔吐甚至死亡[1-2]。據(jù)衛(wèi)計委統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2013—2015年全國發(fā)生的微生物性食物中毒事件中，副溶血性弧菌是主要的病原之一[3-5]。美國CDC數(shù)據(jù)顯示，每年美國發(fā)生大約7880起由弧菌引起的疾病中，有2800起病例是由食用污染副溶血性弧菌的食物引起。副溶血性弧菌的致病性與副溶血性弧菌的污染量和是否攜帶致病基因密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)致病性副溶血性弧菌污染水平高于1×103cfu/mL或1×104cfu/mL時，引發(fā)疾病的概率超過0.1%[6]。副溶血性弧菌的主要致病基因是溶血素相關(guān)基因，耐熱直接溶血素 （thermostable direct haemolysin，tdh）和耐熱相關(guān)溶血素（tdh-related haemolysin，trh）。 絕大多數(shù)從水產(chǎn)品中分離的副溶血性弧菌為tdh-trh-菌株，不具有致病性[6-7]。但對于tdh+/trh+陽性菌株而言，研究發(fā)現(xiàn)不同來源的副溶血性弧菌菌株攜帶毒力因子的種類可能不同[8-10]。Terzi等[8]研究發(fā)現(xiàn)魚類來源的副溶血性弧菌未篩選到tdh+trh-菌株，而貝類來源副溶血性弧菌中未篩選到tdh-trh+菌株。

副溶血性弧菌廣泛存在于河口、海洋、海水養(yǎng)殖池及各類海洋生物體內(nèi)。近年來，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒的首位，尤其是沿海省市[11]。為確定上海市近年來水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染情況，本研究中于2015年7月至2016年6月分別對來自海洋和市售2種途徑的水產(chǎn)品進(jìn)行了副溶血性弧菌的分離、國標(biāo)法定量檢測、分子鑒定及毒力基因的篩查，旨在調(diào)查上海市水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染情況，為加強政府監(jiān)管，追溯其污染來源、污染途徑提供重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

水產(chǎn)品樣品購自上海市銅川路水產(chǎn)批發(fā)市場、上海市軍工路水產(chǎn)批發(fā)市場和上海市蘆潮港碼頭，采樣時間為2015年7月至2016年6月，每月采樣2-4次，共采集206份水產(chǎn)品樣品。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板（TCBS）、胰蛋白胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基（TSB），北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基 （CV），法國科瑪嘉 （CHROMagar）公司產(chǎn)品；BIOWEST regular agarose G-10，法國BIOWEST公司產(chǎn)品；TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；引物、Permix Taq，寶生物工程（大連）有限公司；Bst DNA polymerase large fragment New England Biolab。

1.3 主要儀器設(shè)備

去離子水Milli-Pure，超純水Milli-Q，美國Millipore Sigma公司；電熱恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司產(chǎn)品；振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；ESCO超凈工作臺，美國Airstream公司產(chǎn)品；Bio-Tek酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；產(chǎn)品Eppendorf離心機 5810R，美國Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR儀，美國Eppendorf公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠制造；高壓滅菌鍋，日本TOMY KOGYO公司產(chǎn)品；微型振蕩器，美國Fisher公司產(chǎn)品；Bio-Rad凝膠成像分析儀，美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品采集 每份樣品的采集均進(jìn)行獨立包裝，袋內(nèi)打氧運輸，2 h內(nèi)送達(dá)實驗室，進(jìn)行樣品預(yù)處理。

1.4.2 菌株的分離 按照國標(biāo)GB/T 4789.7-2013，對副溶血性弧菌進(jìn)行分離，選用硫代硫酸鈉檸檬酸膽鹽蔗糖培養(yǎng)基（TCBS）和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基（CV）篩選疑似菌株。

1.4.3 MPN值計算 按照國標(biāo)GB/T 4789.7-2013定量檢測方法，取25 g樣品至225 g APW中，拍打式均質(zhì)機拍擊2 min，將處理后的均質(zhì)液進(jìn)行10倍梯度稀釋。接種環(huán)挑取最適梯度的稀釋液，劃線于TCBS平板及CV平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18~24 h。根據(jù)《副溶血性弧菌最可能數(shù)（MPN）檢索表》計算MPN值。

1.4.4 基因組DNA的提取 挑取疑似副溶血性弧菌單菌落接種于30 g/L氯化鈉TSB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min，培養(yǎng) 3~4 h。按照 TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，Bio-Tek酶標(biāo)儀測定基因組DNA的質(zhì)量濃度。

1.4.5 毒力基因的PCR檢測 以獲得的基因組DNA為模板，副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株33847為tdh陽性對照，副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株17802為trh陽性對照，進(jìn)行副溶血性弧菌的PCR鑒定（tlh）及其毒力基因tdh，trh的鑒定，引物序列及反應(yīng)條件參照高瑋等[12]。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察，取5.0 μL PCR產(chǎn)物點樣于0.02 g/mL的瓊脂糖凝膠中，180 V電壓下電泳30 min，EB染色10 min，利用Bio-Rad凝膠成像分析儀觀察結(jié)果，拍照獲取瓊脂凝膠電泳圖譜。

1.4.6 毒力基因的LAMP檢測 以獲得的基因組DNA為模板，副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株33847為tdh陽性對照，副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株17802為trh陽性對照，進(jìn)行副溶血性弧菌tlh基因、tdh基因和trh基因的LAMP檢測，引物序列及反應(yīng)條件參照韓小龍等[13-14]。LAMP產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行觀察，取3.0 μL LAMP產(chǎn)物點樣于0.02 g/mL的瓊脂糖凝膠中，180 V電壓下電泳25 min，EB染色10 min，利用Bio-Rad凝膠成像分析儀觀察結(jié)果，拍照獲取瓊脂凝膠電泳圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染率

為了解上海市不同類型水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的分布情況，2015年7月至2016年6月對采集的魚、蝦、蟹、貝4大類14種共206份水產(chǎn)樣品進(jìn)行副溶血性弧菌的定性和定量檢測，結(jié)果如表1所示。206份水產(chǎn)樣品中有182份樣品檢測出副溶血性弧菌，污染率達(dá)88.34%，其中污染率最高的水產(chǎn)品為蝦類，污染率為95.18%（79/83），其次為蟹類（88.8%，8/9）、貝類（83.63%，92/110）。 根據(jù)國標(biāo) GB/T 4789.7-2013定量檢測副溶血性弧菌的污染量，結(jié)果表明污染量最高的是蝦類，為2156.57 MPN/hg，其次是貝類（84.78 MPN/hg）?？梢园l(fā)現(xiàn)草蝦的污染率（100%）和污染量（5168.21 MPN/hg）均高于其他水產(chǎn)品種類?；鶉r、斑節(jié)蝦、牡蠣、梭子蟹等日常食用海鮮污染亦較為嚴(yán)重。

2.2 不同地點來源的水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染率

不同地點來源的水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的分布狀況不同，為了解其差異性，本研究中分別從上海市銅川路水產(chǎn)市場、上海市軍工路水產(chǎn)市場和上海蘆潮港碼頭采集206份水產(chǎn)品，副溶血性弧菌污染率如表2所示。水產(chǎn)品市場共采樣135份，污染率為91.11%，MPN值為1361.76 MPN/hg。碼頭共采樣71份海產(chǎn)品，污染率為83.09%，MPN值為88.36 MPN/hg。研究表明無論是污染率還是MPN值，水產(chǎn)品市場都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于碼頭。

2.3 不同季節(jié)水產(chǎn)品副溶血性弧菌污染率

為探究水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的污染情況與季節(jié)之間的相關(guān)性，本研究中對不同季節(jié)采集的206份水產(chǎn)品進(jìn)行副溶血性弧菌分析，其中夏季污染率高達(dá)97.33%，其次是秋季 （93.22%）、春季（80.55%），冬季相較于其他三季來說污染率較低，為69.44%。夏季是副溶血性弧菌生長繁殖的最適季節(jié)，因而MPN值也遠(yuǎn)高于其他3個季節(jié)，為1579.17 MPN/hg。

表1 不同種類水產(chǎn)品副溶血性弧菌污染率Table 1 Prevalence of V.parahaemolyticus in seafoods

表2 不同采樣地點水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染率Table 2 Prevalence of V.parahaemolyticus in seafood purchased from market and wharf

圖1 不同季節(jié)水產(chǎn)品副溶血性弧菌污染情況Fig.1 Prevalence of V.parahaemolyticus in different season

2.4 疑似副溶血性弧菌的PCR、LAMP鑒定

副溶血性弧菌在TCBS選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)為圓形濕潤綠色渾濁菌落，在CV板上為淡紫色圓形濕潤菌落。通過2種不同的副溶血性弧菌選擇性培養(yǎng)基共篩選，獲得201株疑似副溶血性弧菌菌株。選取tlh基因，對疑似副溶血性弧菌分別進(jìn)行PCR、LAMP鑒定，共鑒定出182株副溶血性弧菌株。部分疑似副溶血性弧菌株的鑒定結(jié)果如圖2。

圖2 部分菌株P(guān)CR-tlh及LAMP-tlh電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of tlh PCR and LAMP products

2.5 副溶血性弧菌tdh基因和trh基因PCR、LAMP擴增結(jié)果

tdh、trh2個基因作為副溶血性弧菌的主要毒力基因，為了解其在水產(chǎn)品中的分布狀況，采用PCR和LAMP 2種方法，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33847作為tdh基因陽性對照，ATCC17802作為trh基因陽性對照，對182株副溶血性弧菌進(jìn)行tdh基因和trh基因的擴增。結(jié)果顯示共篩選出5株含有tdh或trh基因的副溶血性弧菌菌株，部分菌株tdh基因和trh基因PCR及LAMP檢測結(jié)果如表3。

表3 部分水產(chǎn)品中分離副溶血性弧菌毒力基因檢測結(jié)果Table 3 Prevalence of V.parahaemolyticus in seafood purchased from market and wharf

2.6 不同水產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌檢出率

為了解不同類型水產(chǎn)品中致病性副溶血性弧菌的分布情況，對分離獲得的182株副溶血性弧菌進(jìn)行毒力基因的分析，結(jié)合菌株的來源分析致病性副溶血性弧菌在水產(chǎn)品中的分布，結(jié)果如表4所示。含tdh基因的副溶血性弧菌菌株3株，污染率為1.6%，含trh基因的副溶血性弧菌菌株2株，污染率為1.0%。3株tdh和2株trh陽性菌株均分離自蝦，貝類、蟹類、魚類均未分離出tdh+或trh+副溶血性弧菌菌株。

副溶血性弧菌作為沿海國家和城市爆發(fā)食源性疾病的首要致病菌，近幾年，中國各地疾病預(yù)防中心對所在地水產(chǎn)品副溶血性弧菌檢測越來越多[15]。本研究中從206份水產(chǎn)品中共分離鑒定出182株副溶血性弧菌，總污染率為88.34%。其中草蝦污染量在所有水產(chǎn)品中最高，為5168.21 MPN/hg，高于蝦類平均污染量一倍。無論是污染率還是污染量，蝦類水產(chǎn)品都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高其他水產(chǎn)品種類，污染情況較為嚴(yán)重。葉兵等[16]對2012年4—11月青島市海產(chǎn)品副溶血性弧菌污染情況進(jìn)行檢測，副溶血性弧菌總污染率為20.39%，其中蝦類污染率為23.8%，貝類為21.57%，蝦類污染率高于貝類，與本研究結(jié)果相符。本研究中草蝦均進(jìn)口于泰國，Thongjun等[17-18]數(shù)據(jù)顯示2006—2010年泰國南部副溶血性弧菌污染率較高且呈現(xiàn)逐步上升趨勢，這也解釋了本研究草蝦的高污染率及高污染量。本研究中副溶血性弧菌總污染率高于其他研究，可能是因為采樣種類的側(cè)重不同，蝦類和貝類樣品數(shù)較其他種類來說較多，水產(chǎn)品產(chǎn)地污染率較高。

表4 不同種類水產(chǎn)品含tdh或trh基因副溶血性弧菌菌株檢出率Table 4 V.parahaemolyticus strains containing tdh+/trh+genes in different seafood

本研究中在上海蘆潮港碼頭收集71份樣品，其中59份樣品中分離出副溶血性弧菌，污染量為88.36 MPN/hg，而在上海市水產(chǎn)批發(fā)市場采樣副溶血性弧菌污染率高達(dá)91.11%（123/135），污染量為1361.76 MPN/hg。水產(chǎn)品市場相對于自然環(huán)境而言具有更高的污染率和污染量，可能是市售水產(chǎn)品在運輸、販賣等環(huán)節(jié)因操作不當(dāng)，造成副溶血性弧菌的交叉污染。彭少杰等[19]對上海2008—2010年上海市不同地點副溶血性弧菌污染的調(diào)查也發(fā)現(xiàn)農(nóng)貿(mào)市場和批發(fā)市場的污染率、污染量均高于其他采樣點。因此，除了保證源頭的安全以外，從農(nóng)場到餐桌等一系列流程都應(yīng)該加強監(jiān)管，主動監(jiān)測，為控制和防御食源性疾病的發(fā)生提供評估數(shù)據(jù)。

采用TCBS和CV 2種副溶血性弧菌選擇性培養(yǎng)基共分離出201株疑似副溶血性弧菌，通過LAMP鑒定182株確認(rèn)為副溶血性弧菌，選擇性培養(yǎng)基的假陽性為9.4%。陳志蕓等[9]研究發(fā)現(xiàn)顯色培養(yǎng)基假陽性結(jié)果為10.1%，與本研究結(jié)果一致。目前眾多研究廣泛使用MPN-PCR方法，Goh等[20-22]利用MPN-PCR的方法對肉類、蔬菜中的單增李斯特菌及副溶血性弧菌進(jìn)行測定。本研究采用MPN、TCBS、CV、PCR、LAMP幾種方法的結(jié)合使用， 確保了實驗結(jié)果的可靠性，且LAMP較PCR而言更加簡便省時，PCR又能防止LAMP的假陽性結(jié)果。

3 結(jié) 語

通過PCR和LAMP 2種方法對副溶血性弧菌主要毒力基因tdh、trh進(jìn)行鑒定，182株副溶血性弧菌中含tdh基因的共有3株，含trh基因的共有2株，均來自于蝦中?？偽廴韭史謩e為1.6%、1.0%。其中蝦類致病菌污染率達(dá)到 6.3%（tdh+：3.8%，trh+：2.5%，tdh+trh+：0%）。陳志蕓等[11]結(jié)果顯示上海市售海產(chǎn)品中副溶血性弧菌tdh、trh攜帶率分別為9.6%、1.0%，其中含有一株tdh、trh雙陽性菌株（1%）。但Yingkajorn等[23-25]研究發(fā)現(xiàn)，從海產(chǎn)品中分離的副溶血性弧菌tdh/trh攜帶率為0%~4.5%，總體研究表明自環(huán)境分離致病性副溶血性弧菌攜帶率較低。