楊 菲，華永慶，林紫微，黃天一，崔 杰，李夢雨，陳婷婷，許惠琴

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

隨著人類社會(huì)工業(yè)化及信息化的發(fā)展，不良的生活作息和環(huán)境污染等因素越來越侵害人們的健康，眼部疾病的發(fā)生率逐年上升[1]。目前，用于眼部疾病模型的研究主要集中在小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和恒河猴等哺乳動(dòng)物，但由于其周期普遍較長，不利于眼部用藥的快速篩選。斑馬魚(Daniorerio)作為一種視覺高度發(fā)達(dá)的模式動(dòng)物，其視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)與人類和其他脊椎動(dòng)物非常相似[2]。斑馬魚眼睛在整體中占較大比重，其胚胎透明的特性便于實(shí)驗(yàn)操作以及器官可視化[3-4]。因此，模式生物斑馬魚用于眼部實(shí)驗(yàn)具有優(yōu)勢。鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)作為常用的增塑劑來增大塑料的可塑性和強(qiáng)度。研究表明，DBP有致癌、致畸、致突變和致哮喘的作用[5]，染毒后尤其容易使機(jī)體的眼部細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究選用斑馬魚作為模式動(dòng)物，用DBP建立眼部細(xì)胞凋亡模型，并觀察藥物的作用，以驗(yàn)證模型的有效性，為眼部用藥的研究提供一種簡單快捷的評(píng)價(jià)方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斑馬魚AB品系，購于凱基生物有限公司，晝夜節(jié)律為晝 ∶夜=14 h ∶10 h；溫度(28.5±0.5)℃。

1.2 藥物與試劑DBP(純度>99.5%，源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S51140)；N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)，純度>99%，購自碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：S0077；人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，Rg1)，純度≥98%,購自源葉生物科技有限公司，批號(hào)：B21057；鏈霉蛋白酶E(Solarbio公司，批號(hào)：721J041)；吖啶橙(Acridine Orange，AO)染色液(1 g·L-1)，購自源葉生物公司，批號(hào)：R20290；MS-222(Sigma, 批號(hào): MKBV1603V)；亞甲藍(lán)(Solarbio公司)。

1.3 儀器M205FA體式熒光顯微鏡(Leica公司)；SPX-150生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)。

2 方法

2.1 藥物溶液的配制

2.1.1胚胎培養(yǎng)液 量取純水1 000 mL，加鹽水調(diào)節(jié)電導(dǎo)率至550～580 μs·cm-1，加入0.1 g·L-1亞甲藍(lán)溶液1 mL，混合均勻，即得。

2.1.2DBP儲(chǔ)備液 精密稱取21 mg DBP，加胚胎培養(yǎng)液至7.54 mL，即得10 mmol·L-1DBP儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱備用，使用時(shí)，用胚胎培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

2.1.3NAC儲(chǔ)備液 精密稱取16.27 mg NAC，加胚胎培養(yǎng)液至1.994 mL，即得500 mmol·L-1NAC儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱備用，使用時(shí)，用胚胎培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

2.1.4Rg1儲(chǔ)備液 精密稱取20 mg人參皂苷Rg1，加胚胎培養(yǎng)液至2.497 mL，即得10 mmol·L-1Rg1儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱備用，使用時(shí)，用胚胎培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

2.1.5鏈酶蛋白酶E溶液 精密稱取25 mg鏈酶蛋白酶E粉末，置于50 mL胚胎培養(yǎng)液中，待完全溶解，即為0.5 g·L-1鏈酶蛋白酶E溶液。

2.1.6AO溶液 取50 μL AO染色液(1 g·L-1)，加9.95 mL胚胎培養(yǎng)液稀釋至5 mg·L-1。

2.1.7麻醉劑 精密稱取三卡因粉末400 mg，加入Tris緩沖液(調(diào)至pH 7)，再加入超純水至100 mL，混合均勻，得三卡因儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱，用時(shí)量取三卡因儲(chǔ)存液4.2 mL，加入超純水至100 mL，混合均勻，即得。

2.2 DBP對(duì)斑馬魚存活率的影響將挑選好的正常胚胎置于6孔板中，每孔20枚，并加入3 mL胚胎培養(yǎng)基，從受精后30 h(hpf)開始加入各濃度DBP(0.1、10、50、100 μmol·L-1)，在正常環(huán)境下培養(yǎng)42 h，于18 h和42 h觀察死亡胚胎數(shù)目，上述實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，數(shù)據(jù)匯總后統(tǒng)計(jì)存活率。

2.3 DBP誘導(dǎo)眼部細(xì)胞凋亡模型將挑選好的正常胚胎置于6孔板中，每孔12枚，并加入3 mL胚胎培養(yǎng)基，從受精后30 h或54 h開始，吸盡胚胎培養(yǎng)基，分別加入各濃度DBP(0.1、1、5、10、50 μmol·L-1)，在直射光(54-324 lux)或非直射光條件下繼續(xù)培養(yǎng)18 h，上述實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。AO染色，并在體式顯微鏡下觀察，眼部綠色熒光顯示為凋亡細(xì)胞，采集圖片并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.4 給藥方式將正常斑馬魚胚胎置于6孔板中，每孔12枚魚卵，并給予3 mL胚胎培養(yǎng)基飼養(yǎng)至30 hpf，吸盡培養(yǎng)基；分組，空白對(duì)照組加入3 mL胚胎培養(yǎng)基，模型組加入3 mL 10 μmol·L-1DBP，6個(gè)給藥組每孔除加入1.5 mL 20 μmol·L-1DBP外，分別加入1.5 mL NAC(0.2、2 mmol·L-1)以及人參皂苷Rg1(0.2、2、10、100 μmol·L-1)，共培養(yǎng)18 h，上述實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。AO染色，并在體式顯微鏡下觀察眼部凋亡細(xì)胞，采集圖片并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

Fig 1 Effect of 18 h(A) and 42 h(B) DBP treatmenton survival rate of

A:Control;B:0.1 μmol·L-1DBP;C:10 μmol·L-1DBP;D:50 μmol·L-1DBP;E:100 μmol·L-1DBP.**P<0.01vscontrol group

A:Control;B:0.1 μmol·L-1DBP;C:1 μmol·L-1DBP;D:5 μmol·L-1DBP;E:10 μmol·L-1DBP;F:50 μmol·L-1DBP

2.5 圖片采集及數(shù)據(jù)處理將胚胎放在有0.5 g·L-1蛋白酶E溶液的培養(yǎng)皿中，在室溫下放置8 min；當(dāng)胚胎有個(gè)別開始脫膜時(shí)，立即加入胚胎培養(yǎng)液稀釋，終止脫膜，迅速將脫膜后的胚胎移入干凈的培養(yǎng)皿中，漂洗2遍后，用5 mg·L-1AO溶液在暗室中染色1 h，進(jìn)而用胚胎培養(yǎng)液漂洗3次，每次5 min，然后用2 mL 0.04 g·L-1的MS-222麻醉5 min，置載玻片上，于體式熒光顯微鏡下鏡檢拍照，采用ImageJ軟件對(duì)斑馬魚眼部凋亡細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度DBP對(duì)斑馬魚存活率的影響為確定DBP對(duì)斑馬魚存活率的影響，在30 hpf后加入0.1、10、50、100 μmol·L-1DBP。加入DBP后18、42 h統(tǒng)計(jì)斑馬魚存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 1)，30 hpf的斑馬魚給予濃度低于10 μmol·L-1的DBP，在42 h內(nèi)不影響幼魚存活率，50、100 μmol·L-1DBP以時(shí)間-劑量依賴的方式降低存活率(P<0.01)。

3.2 不同濃度DBP對(duì)30 hpf的斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響為觀察DBP對(duì)斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響，在30 hpf的斑馬魚培養(yǎng)基中加入0.1、1、5、10、50 μmol·L-1DBP共培養(yǎng)18 h，即斑馬魚受精48 h后，發(fā)現(xiàn)0.1、1、5 μmol·L-1DBP組模型效果不穩(wěn)定，10、50 μmol·L-1DBP誘導(dǎo)斑馬魚眼部凋亡作用最為明顯(P<0.01)，見Fig 2。

3.3 不同濃度DBP對(duì)54 hpf的斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響在上述實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間為受精后48 h，斑馬魚幼魚還未完全出卵，拍照前需要用鏈霉蛋白酶E破卵。為了排除其影響，延長造模前的培養(yǎng)時(shí)間，選擇54 hpf的斑馬魚進(jìn)行DBP造模18 h，即斑馬魚受精72 h，此時(shí)斑馬魚幼魚已經(jīng)完全出卵，不需要鏈蛋白酶E破卵。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 3)，72 hpf的斑馬魚空白組眼部會(huì)產(chǎn)生自發(fā)凋亡，此時(shí)在相同造模條件下觀察，模型組與空白組比較，差異不明顯。因此，最終選擇30 hpf作為斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的開始造模時(shí)間。

3.4 光照對(duì)斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響為了探究斑馬魚在72 hpf生長過程中自身眼部細(xì)胞凋亡的原因，在斑馬魚的培養(yǎng)過程中采用非直射光照，探究直射光與非直射光對(duì)斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 4)，非直射光照對(duì)斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡沒有明顯改善作用。故在建立斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡模型構(gòu)建過程中，可以采取正常的斑馬魚培養(yǎng)光照條件。

綜上所述，在30 hpf的斑馬魚幼魚中，10、50 μmol·L-1DBP造模可見更為明顯的眼部細(xì)胞凋亡，且此時(shí)空白組斑馬魚幼魚未產(chǎn)生自發(fā)性的眼部細(xì)胞凋亡，但是高濃度DBP(50 μmol·L-1)會(huì)影響斑馬魚幼魚的存活率，故最終選擇在正常溫度及光照培養(yǎng)條件下，30 hpf的斑馬魚，10 μmol·L-1DBP造模18 h，作為斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡模型的造模條件。

A:Control;B:0.1 μmol·L-1DBP;C:1 μmol·L-1DBP;D:5 μmol·L-1DBP;E:10 μmol·L-1DBP;F:50 μmol·L-1DBP

3.5 抗凋亡藥物對(duì)斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡的影響在30 hpf的斑馬魚培養(yǎng)基中加入10 μmol·L-1DBP與不同濃度人參皂苷Rg1或NAC共培養(yǎng)18 h。Fig 5結(jié)果表明，模型組與空白組相比，斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡明顯(P<0.01)。與模型組相比，NAC(1 mmol·L-1)和人參皂苷Rg1(1、5、50 μmol·L-1)都能以濃度依賴的方式明顯緩解眼部細(xì)胞凋亡(P<0.05)。

4 討論

斑馬魚已成為研究脊椎動(dòng)物發(fā)育和疾病遺傳機(jī)制越來越受歡迎的模式生物。70%的人類基因至少有1個(gè)斑馬魚直系同源物，84%的已知人類致病基因具有斑馬魚對(duì)應(yīng)物[6]。其眼發(fā)育具有時(shí)空特異性，在受精后24 h時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)、腦發(fā)育和眼發(fā)育形成，48 h時(shí)開始出卵膜，具有視功能，相當(dāng)于人類新生兒時(shí)期[7]。在本研究中，DBP構(gòu)建斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡模型的周期僅48 h，與用傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物造模相比，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，為與眼部細(xì)胞凋亡相關(guān)的眼部用藥的研究提供了快速篩選模型。另一方面，斑馬魚易于飼養(yǎng)，并可低成本大量繁殖，每對(duì)斑馬魚每周可產(chǎn)100～200只魚卵[3]，這一生殖特性極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

DBP已經(jīng)在多種工業(yè)使用了50多年，是最常用的增塑劑，主要用于軟質(zhì)聚氯乙烯(PVC)，在最終產(chǎn)品中最多可占40%。長期暴露于DBP會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生發(fā)育和生殖毒性。DBP在體內(nèi)可減少超氧化物歧化酶、過氧化氫酶，升高丙二醛，造成DNA損傷，引起細(xì)胞凋亡[5]。在斑馬魚從幼魚向成魚生長過程中，DBP會(huì)導(dǎo)致卵黃蛋白原合成減少[8]。在斑馬魚成魚中，DBP延遲睪丸的發(fā)育，減少精子產(chǎn)生，這種影響在除去DBP，用清潔水凈化30 d后可以部分恢復(fù)[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，30 hpf的斑馬魚幼魚暴露在10 μmol·L-1DBP中，采用AO染色技術(shù)，在體式熒光顯微鏡下觀察斑馬魚眼部凋亡細(xì)胞，可見隨劑量和造模時(shí)間的增加，凋亡細(xì)胞呈綠色熒光從眼球中心由內(nèi)向外發(fā)散。在此基礎(chǔ)上，用抗凋亡藥物NAC和人參皂苷Rg1驗(yàn)證該模型能否用于眼部用藥的藥效評(píng)價(jià)。NAC直接保護(hù)DNA免受氮芥、硫芥等烴化劑的損傷，阻止烴化劑引起的細(xì)胞凋亡，在氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷中起抗凋亡作用[10]。而人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分，已有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1具有較好的抗凋亡、抗衰老作用[11]。NAC和人參皂苷Rg1都能夠明顯減少DBP導(dǎo)致的斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DBP引起的眼部細(xì)胞凋亡是可被藥物逆轉(zhuǎn)的，這為斑馬魚用于眼部疾病研究的可行性及合理性提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除斑馬魚HSF1或gdf6a基因，可造成斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡[12-13]，但是由于基因敲除后對(duì)機(jī)體的影響未知，是否適用于眼部用藥篩選有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，應(yīng)用DBP建立斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡模型，具有靈敏、高效、便捷、低成本、周期短等特點(diǎn)，為眼部疾病的治療藥物研究提供新方法。