喻 斌，阮 鳴，許 立，劉圣金，許惠琴，沈祥春

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)部省共建中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，江蘇省中藥藥效與安全性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2. 南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211117；3. 貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

根據(jù)國家心血管病中心發(fā)布的《中國心血管病報(bào)告2016》，我國居民的首要死因?yàn)槟X血管疾病的省份有27個(gè)。此外，與1990年比較，缺血性腦卒中的死亡率上升了28.8%[1]。顯然，腦血管疾病的防治目前仍然是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。神經(jīng)元興奮毒是腦缺血/再灌注后的后繼反應(yīng)，表現(xiàn)為興奮性氨基酸觸發(fā)以鈣超載為代表的損傷反應(yīng)，后者又反過來進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷，形成惡性循環(huán)。

川芎和冰片配伍來自宋《圣濟(jì)總錄》卷十五“清神散”化裁而來。后者由川芎、莎草根、石膏、冰片4味藥組成，主治腦中風(fēng)、頭痛等癥。近年來臨床研究表明，川芎-冰片配伍對腦缺血具有明顯治療作用[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，川芎的活性成分川芎嗪和冰片配伍后，對全腦缺血/再灌注(global cerebral ischemia reperfusion, GCIR)損傷大鼠的皮層、海馬、下丘腦和紋狀體均表現(xiàn)較好的改善作用[3]，并且這一改善作用伴隨著冰片劑量的差異，還表現(xiàn)出一定的腦區(qū)特異性[4]。在進(jìn)一步的機(jī)制研究中，我們發(fā)現(xiàn)川芎嗪和冰片配伍抗腦缺血的作用機(jī)制與減少神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)自噬形成有關(guān)[5-6]?？紤]到川芎嗪為川芎的活性成分之一，川芎和冰片的配伍又涉及哪些機(jī)制呢？目前還未見研究報(bào)道。基于以上背景，我們開展本次研究。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑川芎提取物的制備：川芎藥材購于江蘇省中醫(yī)院，粉碎，過40目篩，加入20倍體積的50%乙醇，回流提取2 h，濾過，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，殘?jiān)蒙睇}水(normal saline，NS)溶解，濃度為2.0 kg(生藥量)·L-1。冰片購于北京同仁堂藥店，北京三和藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)77820501。以上藥材經(jīng)本校中藥鑒定教研室劉圣金副教授鑒定為正品。冰片溶液的配制方法為：取3.2 g，磨碎，加丙二醇溶解，加聚乙二醇400和吐溫-80，再加水至100 mL，終濃度為32 g(生藥量)·L-1。人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)，配方為(mmol·L-1)：KCl 2.5、NaCl 125、MgCl2·6 H2O 1.18、CaCl2·2 H2O 1.26、NaH2PO4·H2O 0.5、Na2HPO4·2 H2O 5。甘氨酸(glycine，Gly)、谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品鑒定研究院，批號(hào)分別為20160817、20160115、20141211；Fluo-3/AM 探針(批號(hào)10F0402)，美國Biotium公司；TUNEL凋亡測試盒(批號(hào)10768100)，美國羅氏公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200±20)g，購于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK(滬)2013-0006。

1.3 儀器微透析系統(tǒng)：RWD302型雙通道微透析注射泵(深圳瑞沃德)，配備A-Z-X-Y安全性腦用探針(內(nèi)徑/外徑200/220 μm，截留分子量50 ku，日本Eicom公司)；Agilent 7890A/5975C氣-質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫)，配有Agilent G4513A自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent HP-5MS毛細(xì)管柱、Agilent色譜工作站和NIST2008質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫；TCS-SP5型激光共聚焦顯微系統(tǒng)(德國萊卡)；IX71熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.4 方法

1.4.1GCIR模型的復(fù)制及分組 按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行4-動(dòng)脈阻斷法復(fù)制GCIR模型。麻醉大鼠，頸正中切口并分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。頸背部正中切口，分離肌層，暴露第1頸椎橫突翼孔，直視下電凝其下通過的椎動(dòng)脈，使雙側(cè)椎動(dòng)脈永久閉塞。術(shù)后大鼠縫皮回籠。24 h后用無創(chuàng)小動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成全腦缺血。缺血20 min，松開動(dòng)脈夾再灌注。按照Pulsinelli等[7]報(bào)道確定模型成功標(biāo)準(zhǔn)，將造模成功的大鼠分為4組：模型組、川芎組(1.0 g·kg-1)、冰片組(0.16 g·kg-1)、川冰組(1.0 g·kg-1川芎+0.16 g·kg-1冰片)，另制備假手術(shù)組。模型組和假手術(shù)組給予NS。連續(xù)灌胃給藥7 d后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4.2Glu、Gly和GABA的測定

1.4.2.1腦微透析液的收集 大鼠麻醉后，用腦立體定位儀固定，剔除大鼠腦部的毛發(fā)，剪開皮膚，剝離皮下組織至腦殼，按照海馬和下丘腦的腦區(qū)坐標(biāo)(海馬AP -3.8 mm, ML +2.0 mm, DV -3.0 mm，下丘腦AP -2.0 mm, ML +0.4 mm, DV -8.2 mm)，用牙科鉆打穿腦頂位置的投射點(diǎn)，植入微透析探針。探針灌注ACSF，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間保持2.0 μL/min的流速。整個(gè)系統(tǒng)穩(wěn)定1.5 h后，兩個(gè)腦區(qū)同時(shí)進(jìn)行微透析，透析30 min后，透析液于-80 ℃存儲(chǔ)。微透析完畢后，取腦于福爾馬林固定，組織學(xué)檢查以確定探針位置是否正確，如不正確，則該樣本不計(jì)。

1.4.2.2樣本預(yù)處理 取樣本50 μL于1.5 mL離心管中，加入350 μL(1 ∶50)稀鹽酸，渦旋振蕩30 s，上清液用真空離心濃縮儀濃縮。加入60 μL甲氧基溶液(15 g·L-1，溶于吡啶)渦旋振蕩30 s，在37 ℃條件下反應(yīng)2.5 h，最后加入60 μL BSTFA試劑(含1%三甲基氯硅烷)，37 ℃條件下反應(yīng)3 h。經(jīng)過以上的反應(yīng)，用GC-MS聯(lián)用儀進(jìn)行檢測。根據(jù)Glu、Gly和GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.4.2.3色譜條件 色譜柱HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，分流比20 ∶1。進(jìn)樣口溫度280 ℃，離子源溫度250 ℃，接口溫度150 ℃。程序升溫起始溫度70 ℃；保持2 min，以10 ℃·min-1升至300 ℃，保持5 min?？傔\(yùn)行時(shí)間為30 min， 載氣為氦氣，載氣流速1 mL·min-1。MS條件：倍增電壓1 787 V，電子轟擊離子(EI)源，電子能量70 eV，掃描方式：全掃描，檢測質(zhì)荷比范圍50～300 m/z。

1.4.3腦內(nèi)鈣離子濃度的測定 參照文獻(xiàn)方法，大鼠斷頭，迅速取腦，浸入0 ℃預(yù)先飽和混合氧氣(95% O2+5% CO2)的ACSF。分離出海馬和下丘腦組織后，經(jīng)振動(dòng)切片機(jī)制成400 μm厚的腦片，移入ACSF中，室溫下恢復(fù)孵育60 min后，在37 ℃含F(xiàn)luo-3/AM(10 μmol·L-1)的ACSF中再孵育30 min，選擇在3～5 min保持熒光值穩(wěn)定的神經(jīng)元進(jìn)行監(jiān)測，檢測時(shí)使用雙激發(fā)單發(fā)射的方式進(jìn)行掃描，雙激發(fā)波長分別為340 nm和380 nm，發(fā)射波長為505 nm，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度由2種波長熒光強(qiáng)度的比值(F340/F380)反映。

1.4.4凋亡率的測定 取腦組織，分離出海馬和下丘腦后，于4%多聚甲醛溶液固定，包埋、切片，按照試劑說明書方法進(jìn)行染色，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。凋亡細(xì)胞以細(xì)胞核呈棕黃色著色為陽性細(xì)胞。在高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占百分率。

1.4.5電鏡檢測 取海馬和下丘腦組織，于2.5%戊二醛固定后，經(jīng)0.1 mol·L-1磷酸漂洗、1%鋨酸固定，脫水、包埋、固化、超薄切片后，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察、攝片。

2 結(jié)果

2.1 川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦組織中Glu、Gly和GABA含量的影響GC-MS檢測的代表性總離子流圖見Fig 1，可見各成分之間分離完全，無干擾。各氨基酸成分的線性回歸方程見Tab 1。結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬和下丘腦兩個(gè)腦區(qū)興奮性氨基酸Glu水平均明顯升高，同時(shí)抑制性氨基酸Gly和GABA均明顯降低(P<0.01)，提示興奮性毒的發(fā)生。與模型組比較，川芎可明顯升高這兩個(gè)腦區(qū)的GABA水平(P<0.05，P<0.01)，但對Gly和Glu未見明顯影響。而冰片僅降低這兩個(gè)腦區(qū)組織的Glu，對GABA和Gly無明顯改善。當(dāng)它們配伍應(yīng)用后，除了可改善海馬和下丘腦的Glu和GABA含量，還可進(jìn)一步升高下丘腦Gly含量(P<0.05，P<0.01)，顯示較好的協(xié)同效應(yīng)(Tab 2)。

Fig 1 Representative total ion chromatogram of Glu, Gly and GABA in hippocampus(A) and hypothalamus(B) by GC-MS

Tab 1 Linear equation and range of Gly, GABA and Glu

2.2 川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦區(qū)域神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度的影響如Fig 2所示，與假手術(shù)組比較，GCIR處理后可見大鼠海馬和下丘腦腦片細(xì)胞中鈣離子濃度明顯升高(P<0.01)，提示鈣超載已發(fā)生。與模型組比較，川芎和冰片單一用藥治療均可明顯降低兩個(gè)腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(P<0.05)，而它們聯(lián)合治療效果更佳(P<0.01)，進(jìn)一步體現(xiàn)了它們配伍應(yīng)用的優(yōu)勢。

2.3 川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦神經(jīng)元凋亡率的影響如Fig 3所示，凋亡陽性細(xì)胞可見細(xì)胞核的棕黃色染色。GCIR處理后可見大量的凋亡神經(jīng)細(xì)胞在大鼠海馬和下丘腦組織出現(xiàn)(P<0.01)。川芎單一用藥治療或聯(lián)合冰片治療可明顯降低兩個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)元凋亡指數(shù)(P<0.01)，但單一冰片治療卻未見明顯改善(P>0.05)。

2.4 川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦區(qū)域神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響Fig 4的透射電鏡結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬和下丘腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜和核膜完整，線粒體無腫脹，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)可見，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完整光滑。模型組大鼠已出現(xiàn)線粒體腫脹，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)消失，甚至空泡化，胞質(zhì)內(nèi)其他細(xì)胞器溶解消失，核膜和胞膜的連續(xù)性被破壞，核膜溶解。給予川芎和冰片治療后，可見以上結(jié)構(gòu)有所改善，細(xì)胞器溶解減少，尤其是線粒體結(jié)構(gòu)空泡化減少，兩者的合用改善效果更加明顯。

3 討論

自1969年Olney提出興奮毒性概念以來，至今一系列研究已證明，興奮性氨基酸(excitative amino acid，EAA)作為后繼級(jí)聯(lián)反應(yīng)的觸發(fā)事件，在腦缺血/再灌注引起的神經(jīng)元死亡中起到重要的作用。大腦的EAA以谷氨酸為代表，含量也最高，占游離氨基酸的40%，其與腦缺血的關(guān)系也最為明確。抑制性氨基酸以GABA和Gly為代表。這兩種神經(jīng)氨基酸的比例在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮/抑制平衡中具有重要作用。缺血性腦損傷首先引起腦組織能量耗竭，導(dǎo)致Na+-K+-ATP酶活性降低，引起胞內(nèi)Na+濃度增加，后者除了可引起神經(jīng)細(xì)胞水腫外，還可抑制Glu的再攝取，導(dǎo)致胞外Glu濃度大幅增加，然后通過激活NMDA受體門控Ca2+通道，增加胞內(nèi)Ca2+濃度，后者又進(jìn)一步激動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ryanodine受體2，促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+超載。而Ca2+超載除了引發(fā)基于NO、磷脂酶C、磷脂酶A2、氧自由基等途徑的神經(jīng)元損傷外，還可通過上調(diào)p53基因及其下游基因Bax，下調(diào)Bcl-2基因和激活caspase-3通路，觸發(fā)凋亡通路，最終造成神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷。

Fig 2 Synergic effect of CR and BO on improving intracellular[Ca2+]i in hippocampus and hypothalamus of GCIR vs sham;*P<0.05,**P<0.01 vs model

##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦缺血屬于腦卒中的范疇，瘀血閉阻腦脈是其基本病機(jī)，活血、化瘀、開竅、醒神作為第一治則。川芎及其活性成分川芎嗪對缺血性腦損傷的保護(hù)作用已被大家所普遍認(rèn)可，并在臨床廣泛應(yīng)用。近年研究發(fā)現(xiàn)這一保護(hù)作用與它們抑制NF-κB，激活I(lǐng)κB，減少神經(jīng)元氧化損傷及凋亡密切相關(guān)[8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，冰片的“引藥上行”功效與促進(jìn)血腦屏障生理性開放，促進(jìn)藥物入腦有關(guān)[9-11]。但大量研究證實(shí)，冰片自身作為“醒腦開竅”藥對腦缺血/再灌注機(jī)體也具有改善行為學(xué)異常，減少腦梗死面積，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的效應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制腦內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧酶和脂氧酶活性，減少NF-κB表達(dá)，抑制TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)形成有關(guān)[12-13]。黃萍等[14]發(fā)現(xiàn)，冰片與川芎配伍后，對腦缺血?jiǎng)游锞哂斜Ｗo(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、基膜的完整性，改善微循環(huán)，減輕腦水腫程度的作用，并且作用明顯優(yōu)于單用川芎或冰片，其作用機(jī)制可能與減少缺血腦組織中NO的生成，減輕NO介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，提高自由基清除酶的活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。我們在前期研究中，針對皮層、海馬、紋狀體和下丘腦4個(gè)腦區(qū)分別進(jìn)行了川芎、冰片的配伍研究，發(fā)現(xiàn)川芎與不同劑量的冰片配伍，在腦循環(huán)、組織學(xué)評分、炎癥因子、氧化應(yīng)激等指標(biāo)的改善中具有明顯的腦區(qū)特異性，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)冰片劑量為0.16 g·kg-1時(shí)，對海馬和下丘腦改善作用最為明顯[15]。

Fig 4 Synergic effect of CR and BO on ultrastructures in hippocampus and hypothalamus of GCIR rats(×10 000)

本實(shí)驗(yàn)觀察川芎和冰片配伍對GCIR大鼠海馬和下丘腦的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)川芎僅升高這兩個(gè)腦區(qū)的GABA，冰片僅降低這兩個(gè)腦區(qū)組織的Glu。而配伍應(yīng)用還可進(jìn)一步升高下丘腦Gly含量，表現(xiàn)較好的協(xié)同關(guān)系。川芎和冰片單用均可降低兩個(gè)腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，緩解超微結(jié)構(gòu)的損傷性改變，而它們的聯(lián)合治療作用更加明顯。這些結(jié)果提示，川芎和冰片配伍可在緩解神經(jīng)元毒性、鈣超載和超微結(jié)構(gòu)異常方面表現(xiàn)較好的協(xié)同效應(yīng)。但在抗凋亡方面，川芎單用即可減少這兩個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)元凋亡指數(shù)，與冰片配伍未見改善作用的進(jìn)一步增強(qiáng)。