郝艷艷，聶春霞，何 盼，武曉偉，劉 聰，郝旭亮

(1. 山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，山西 太原 030045；2. 山西省中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西 太原 030619)

黨參是桔?？浦参顲odonopsispilosula(Franch.) Nannf.川黨參CodonopsistangshenOliv.和素花黨參CodonopsispilosulaNannf var.modesta(Nannf.)L. T. Shen的干燥根[1]。具補中益氣、健脾益肺的作用，是中醫(yī)常用補氣藥。作為補益類中藥材，黨參在機體免疫調(diào)節(jié)方面的研究廣泛而深入。張曉君等[2]發(fā)現(xiàn)，黨參多糖對體液免疫有較強促進作用。張雅君等[3]的研究也發(fā)現(xiàn)，黨參粗多糖提取液可促進小鼠脾臟B淋巴細胞的增殖，提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力，進而調(diào)整機體免疫功能。

歷代中醫(yī)家對黨參炮制也較為重視，通過輔料或不同炮制方法讓黨參的功效也各有不同。如米炒后的黨參健脾的作用增強，蜜炙后的黨參益氣作用增強[4]，酒炙和蜜炙可升高黨參的多糖含量，米炒、麩炒可使黨參多糖含量降低[5]。楊中林等[6]研究黨參不同炮制品時發(fā)現(xiàn)：在提高小鼠巨噬細胞吞噬能力方面，蜜炙黨參優(yōu)于米炒黨參和生黨參，初步證明臨床補氣用傳統(tǒng)的蜜炙法炮制品為佳。本文利用代謝組學(xué)技術(shù)，旨在進一步明確黨參不同炮制品對環(huán)磷酰胺(cylophosphamide，CTX)所致免疫抑制大鼠的影響，并深入研究其作用機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑黨參飲片(批號：20180104)、米炒黨參飲片(批號：20180110)、蜜炙黨參飲片(批號：20180101)，由山西振東集團提供，均為潞黨參及其炮制品。氯化鈉注射液(杭州民生藥業(yè)集團有限公司)；CTX(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號：18022125)；IL-2 ELISA試劑盒、免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA試劑盒，均購自美國ADL公司；氘代重水(D2O)，購自美國Sigma-aldrich公司。

1.2 儀器KDC-2046高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司)；HEMAVET 950FS全自動血液分析儀(美國Drew Scientific公司)；貝克曼流式細胞儀Cytomics FC 500(COULTER TQ-Prep工作站)；Synergy H1酶標儀(BioTek公司)；Bruker AVANCE III 600超導(dǎo)高分辨核磁共振譜儀(德國Bruker公司)。

1.3 樣品制備黨參及其各炮制品飲片60 ℃烘干，加8倍水煎煮3次，每次1 h，過濾，濾液濃縮至一定濃度，60 ℃常壓烘干，備用。

2 方法

2.1 動物分組及給藥50只SPF級SD大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量(180±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為5組，每組10只，♀♂各半，即空白對照組(NS)、模型組(MS)、黨參藥材(Cp，3.75 g·kg-1生藥)、蜜炙黨參(HCp，3.75 g·kg-1生藥)、米炒黨參(RCp，3.75 g·kg-1生藥)。各給藥組按每只大鼠10 mL·kg-1劑量灌胃相應(yīng)藥物，空白對照組及模型組給予等體積生理鹽水；連續(xù)14 d，每天1次。給藥d 1起，除空白對照組外，各組均腹腔注射CTX(40 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)3 d，同時治療給藥。實驗前禁食(不禁水)12 h。最后1 d給藥1 h后，腹主動脈取血，一部分血置于抗凝管中；剩余血液置于EP管中，靜置1 h左右，3 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液，分裝，-20 ℃冰箱保存，備用。摘取十二指腸、空腸和回腸(各約3 cm)置于平皿中，縱行剖開，刮取腸黏膜黏液，收集于同一離心管。內(nèi)容物與生理鹽水按1 ∶1(W/V)稀釋，混勻后，3 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 指標檢測部分外周血用動物血球計數(shù)儀計數(shù)外周血細胞；剩余部分外周血用流式細胞儀檢測T細胞亞群CD4+、CD8+表達。采用ELISA法，分別檢測血清中IL-2、IgG的含量，ELISA法檢測腸道sIgA含量。

2.3 核磁樣品制備與測試將400 μL解凍的血清加入311 μL D2O，渦旋30 s，4 ℃、13 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液600 μL于5 mm核磁管中進行核磁測試。采用Bruker 600 MHz AVANCE Ⅲ NMR譜儀采集數(shù)據(jù)，CPMG序列壓制水峰，掃描次數(shù)為64，譜寬12 345.7 Hz，圖譜大小65 536數(shù)據(jù)點，脈沖寬度(PW)=30°(12.7 us)，傅里葉變換LB=0.3 Hz，延遲時間為5.0 s。

2.41H NMR圖譜處理與分析采用MestReNova核磁圖譜處理軟件(version 8.0.1)對所有1H NMR圖譜進行手動相位和基線調(diào)整。所有圖譜以肌酸(δ 3.04)為標準進行化學(xué)位移、相位與基線校正，對δ 0.60～9.00區(qū)域的譜圖進行0.01等寬度分割積分，切除水峰δ 4.50～5.00。剩余積分數(shù)據(jù)歸一化后，運用SIMCA-P 13.0(Umetrics，瑞典)軟件進行多元統(tǒng)計分析。主成分分析(principal component analysis，PCA)反映的是樣本內(nèi)部固有的差異性和相似性，以顯示數(shù)據(jù)的原始分類狀態(tài)，進一步進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)，用排列實驗(permutation tests，200次)來驗證PLS-DA的有效性。結(jié)合OPLS-DA的VIP值和相應(yīng)的s-plot圖，尋找組間的差異代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)果

3.1 免疫細胞結(jié)果Tab 1結(jié)果表明，與對照組相比，模型組白細胞總數(shù)、B淋巴細胞數(shù)及T細胞常數(shù)，結(jié)合BMRB(Biological Magnetic Resonance Data Bank, http://www.bmrb.wisc.edu/)數(shù)據(jù)庫，以及文獻[7-9]中數(shù)據(jù)對圖譜進行指認，在大鼠血清中共指認出32種代謝產(chǎn)物，包含大量的氨基酸、碳水化合物、有機酸等，結(jié)果見Tab 3(Fig 1中標號與Tab 3相對應(yīng))。

Fig 1 Typical 1H NMR spectrum of serum from rats

Tab 1 Effect of Codonopsis pilosula and its differentprocessed products on counts of

**P<0.01vsNS;#P<0.05,##P<0.01vsMS

CD4+/CD8+值明顯降低(P<0.01)，說明免疫低下模型復(fù)制成功；給藥后，黨參組(P<0.01)、蜜炙組(P<0.01)和米炒組(P<0.05)均有明顯升高，說明3組炮制品均可明顯提高機體免疫細胞水平。

3.2 免疫因子結(jié)果Tab 2結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組各免疫因子含量明顯降低(P<0.01)；給藥后，黨參組(P<0.05)、米炒黨參組(P<0.01)、蜜炙黨參組(P<0.01)對IL-2均有明顯回調(diào)作用；黨參組對IgG有升高作用(P<0.01)，米炒黨參組和蜜炙黨參組則沒有變化；對于sIgA，只有蜜炙組對其有回調(diào)作用(P<0.05)，米炒組和黨參組沒有變化。

3.3 黨參不同炮制品對免疫抑制大鼠血清的代謝組學(xué)結(jié)果

3.3.1血清1H NMR圖譜的指認與分析 大鼠血清的核磁圖譜見Fig 1。根據(jù)化學(xué)位移、峰形、偶合為了進一步分析模型組與空白組之間的差異，首先采用PCA散點圖(Fig 3A)觀察兩組樣本的分離趨勢，可以看出模型組與空白組明顯分離；進一步采用PLS-DA分析(Fig 3B)，并在PLS-DA模型成立的基礎(chǔ)上，對原始數(shù)據(jù)建立排列實驗，表明隨機變量Y變量產(chǎn)生的R2、Q2均小于原始值(Fig 3C，R2=纈氨酸、醋酸、葡萄糖、丙酮酸含量降低；異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰0.995，Q2=0.875)，證明模型有效可靠。通過S-plot(Fig 3D)結(jié)合VIP值，進行獨立樣本t檢驗(P<0.05)尋找差異代謝物，得到14個具有顯著性差異的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。與空白對照組相比，模型組中糖蛋白、O-乙酰糖蛋白、甘油磷酰膽堿(GPC)、鯊肌醇含量升高。所有差異代謝物在各組中的含量分布見Fig 4，結(jié)果表明，蜜炙黨參組基本對所有差異代謝物均有明顯回調(diào)作用，黨參組和米炒黨參組對個別代謝物有明顯回調(diào)作用。

Tab 2 Effects of different processed products of

*P<0.05,**P<0.01vsNS;#P<0.05,##P<0.01vsMS

3.3.2多元統(tǒng)計分析 由于NMR圖譜反映的信息較多，很難直觀地反映出各組之間的差異，因此借助多元統(tǒng)計分析做進一步的分析。采用PCA 3D散點圖對所有樣本進行分析, 以顯示數(shù)據(jù)的原始分類狀態(tài)(Fig 2)，可以看出對照組與模型組明顯分離，表明模型復(fù)制成功；黨參組在三維空間里更接近于模型組，而蜜炙黨參組和米炒組與模型組明顯分開，說明蜜炙黨參組和米炒組與模型組差異較大；其中蜜炙黨參組與模型組相距最遠，提示蜜炙黨參組具有明顯回調(diào)作用。

Tab 3 1H NMR assignments of major metabolites from serum of rats

PC: Phosphatidylcholine; GPC: Glycerophosphocholine; TMAO: Trimethylamine oxide; m: multiple peaks; s: single peak; d: double peaks; t: triple peaks; J: coupling constant.

Fig 2 PCA 3D score plot of rat serum among all groups

3.3.3代謝通路分析 將找到的差異代謝物輸入www.metaboanalyst.cn進行Met PA分析，將Pathway Impact>0.1的代謝途徑列為最重要的代謝途徑，得到與免疫低下模型相關(guān)的代謝通路如Fig 5所示。

Fig 3 PCA score plot(A),PLS-DA score plot(B),correspondingvalidation(C),and S-plot(D) from serum of rat between control and model groups

4 討論

4.1 免疫細胞結(jié)果分析白細胞是體內(nèi)防御系統(tǒng)的重要組成部分，其數(shù)量的減少代表著機體免疫功能低下[10]。B淋巴細胞是體液和細胞免疫的重要組成部分，能夠通過多種調(diào)控方式發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)作用。T細胞在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮中樞的作用，CD4+T細胞具有輔助細胞免疫和體液免疫應(yīng)答的作用，CD8+T細胞則是重要的效應(yīng)細胞，兩者的比值可以反映機體免疫功能水平。給藥后，黨參組及各炮制品組均可明顯升高模型大鼠白細胞、B淋巴細胞及T細胞CD4+/CD8+值水平。與米炒黨參相比，黨參組和蜜炙黨參組在改善CTX引起的白細胞及淋巴細胞數(shù)減少方面效果更好。各給藥組在提高T細胞CD4+/CD8+值方面效果相當。

4.2 免疫因子結(jié)果分析sIgA是構(gòu)成腸道黏膜免疫的重要組成成分，也是維持其穩(wěn)態(tài)的第一道防線。IL-2是重要的免疫調(diào)控因子，可直接增強T細胞介導(dǎo)的細胞免疫功能，能促進T細胞生長、增殖、分化及抗體形成[11]等。IL-2也可直接活化B細胞，使其生長并刺激抗體產(chǎn)生，故也是一種B細胞生長因子，促進B細胞介導(dǎo)的體液免疫[12]。IgG是免疫系統(tǒng)重要的組成部分，其含量一定程度上反映了機體免疫功能的強弱。給藥后，黨參可明顯提高IL-2、IgG水平；蜜炙黨參明顯改善免疫抑制引起的IL-2、sIgG含量降低；米炒黨參升高模型大鼠IgG水平明顯。

4.3 代謝通路分析亮氨酸、異亮氨酸，是蛋白質(zhì)和葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)器[13]，也是維持淋巴細胞敏感性與免疫細胞功能所必需的功能物質(zhì)。纈氨酸屬生糖氨基酸，可促進糖異生，還能通過影響免疫球蛋白的合成來影響免疫功能[14]。本實驗中，米炒組、蜜炙組纈氨酸含量升高，說明給予其可促進機體葡萄糖的生成，產(chǎn)生更多能量，同時合成免疫球蛋白，提高機體免疫力；蜜炙黨參組亮氨酸、異亮氨酸含量降低，說明蜜炙組促進其代謝，維持機體各免疫細胞的功能，從而增強機體免疫力。

谷氨酸、谷氨酰胺是淋巴細胞和中性粒細胞等快速分裂的主要能源物質(zhì)，在其代謝過程中起氮的載體和供體作用，可間接提高白細胞與淋巴細胞的增殖，改善機體免疫作用[15]。給藥后，谷氨酸、谷氨酰胺含量降低，推測谷氨酸、谷氨酰胺不斷快速代謝，從而加速淋巴細胞增殖，提高機體免疫力，這一變化與免疫細胞結(jié)果相一致。

丙氨酸和谷氨酸是體內(nèi)重要氨基酸，通過氨基轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化。丙氨酸是肝臟合成葡萄糖的主要底物，影響白細胞的合成，進而影響機體免疫功能。有研究表明，在B淋巴細胞雜交瘤中添加2 mmol·L-1的丙氨酸可以防止細胞凋亡、促進細胞生長以及刺激抗體的產(chǎn)生[16]。模型組大鼠血清丙氨酸及谷氨酸含量升高，表明CTX引起機體丙氨酸和谷氨酸的蓄積，利用率明顯降低，從而造成免疫抑制。黨參各炮制品治療后，丙氨酸和谷氨酸水平均有向?qū)φ战M回調(diào)的趨勢，其中以蜜炙黨參組效果最明顯，表明黨參可以促進丙氨酸和谷氨酸的代謝，從而修復(fù)機體免疫功能缺陷。

葡萄糖、丙酮酸是糖代謝中重要能源物質(zhì)，機體進行有氧代謝時，葡萄糖生成丙酮酸后，進入三羧酸循環(huán)，保證機體正常供能。本實驗中，蜜炙黨參組葡萄糖和丙酮酸含量高于模型組，說明免疫低下模型大鼠的糖代謝以無氧代謝為主，而黨參組以有氧代謝為主，從而提高機體供能水平。

Fig 5 MetPA analysis of metabolic pathway

1:Valine, leucine, isoleucine metabolism; 2: Glutamate, glutamine metabolism; 3: Alanine, asparticacid, glutamicate metabolism.

GPC參與細胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可調(diào)節(jié)細胞膜的流動性，屬脂質(zhì)代謝的中間體。本實驗中，蜜炙黨參組GPC含量降低，說明蜜炙黨參可以改善CTX誘導(dǎo)的細胞膜的損傷，維持免疫細胞的結(jié)構(gòu)和功能。

乙酰糖蛋白作為炎癥反應(yīng)的急性期反應(yīng)蛋白[17]，在機體受到刺激發(fā)生炎癥反應(yīng)后含量升高[18]。本研究中，蜜炙黨參組O-乙酰糖蛋白、N-乙酰糖蛋白含量低于模型組，表明CTX誘導(dǎo)免疫低下大鼠的炎癥反應(yīng)發(fā)生，蜜炙黨參可促使機體免疫反應(yīng)恢復(fù)，免疫力趨于正常。

本研究基于1H NMR代謝組學(xué)技術(shù)，對比了黨參及其不同炮制品(米炒黨參、蜜炙黨參)對免疫抑制大鼠的影響。結(jié)果表明，對于CTX所致的免疫低下大鼠，蜜炙黨參改善效果優(yōu)于黨參和米炒黨參，表現(xiàn)在明顯提高大鼠血清中白細胞、淋巴細胞及CD4+/CD8+值、IL-2、sIgA的含量，明顯回調(diào)血清中12個內(nèi)源性代謝物的水平，主要通過纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸代謝，谷氨酸、谷氨酰胺代謝以及丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝3條通路，以及其他物質(zhì)(如葡萄糖、丙酮酸、GPC以及乙酰糖蛋白)的代謝來發(fā)揮免疫作用。該研究結(jié)果為黨參藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其不同炮制品的臨床精準化使用提供了理論依據(jù)。