韓錫萍，張 鵬，于 凡，馮 磊，馬 鑫

(江南大學(xué)1. 藥學(xué)院、2. 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

目前研究認(rèn)為，瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)離子通道是一類在細(xì)胞膜上分布的非選擇性陽離子通道，參與內(nèi)皮細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[1]。瞬時受體電位香草素4(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)通道是TRP通道家族香草素亞家族(TRPV)成員，其在內(nèi)皮細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)多種血管功能，包括應(yīng)答血流剪切力、調(diào)節(jié)血管張力、機械信號傳導(dǎo)及血管新生等[2]。高鹽攝取是許多常見疾病的誘導(dǎo)因素，降低高鹽的攝入可降低血壓并改善心血管功能[3]。已有研究表明，通過喂食Wistar大鼠高鹽飼料，發(fā)現(xiàn)當(dāng)高鹽飲食導(dǎo)致血壓大幅升高時，內(nèi)皮細(xì)胞中由TRPV4介導(dǎo)的血管舒張功能下調(diào)，甚至被全面抑制[4]。這些研究表明，TRPV4通道在高鹽攝入所引起的內(nèi)皮功能失調(diào)中發(fā)揮重要的作用。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是健康的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的氣體遞質(zhì)。研究表明，在冠狀動脈中，NO可以抑制其異常收縮；在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，NO可以起到松馳血管平滑肌和舒張血管的作用[5-7]。內(nèi)皮細(xì)胞中的NO主要由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化L-精氨酸產(chǎn)生，該酶活性對Ca2+濃度有依賴性[8]。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，其濃度調(diào)節(jié)主要受胞內(nèi)鈣庫Ca2+釋放和胞外Ca2+內(nèi)流控制，鈣庫釋放速度快，但維持時間短；而鈣內(nèi)流可以使細(xì)胞內(nèi)鈣持續(xù)增高，調(diào)節(jié)長期的細(xì)胞效應(yīng)，如細(xì)胞內(nèi)NO合成等[9-10]。這些研究表明，Ca2+通過影響eNOS的活性，對NO的生成產(chǎn)生重要的作用，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的功能。

TRPV4與NO均參與血管功能調(diào)節(jié)，然而，對于高鹽模型下，TRPV4對NO的具體影響目前尚未完全清楚。我們猜測高鹽模型下，內(nèi)皮細(xì)胞中的TRPV4通道受到影響，對NO存在一定的作用，從而影響到血管的功能。因此，我們在細(xì)胞水平上誘導(dǎo)高鹽模型，發(fā)現(xiàn)胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TRPV4介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流下降，NO的生成減弱，進(jìn)而在血管內(nèi)皮功能失調(diào)過程中產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康野生型C57BL6/J小鼠30只，♂，4～8周齡，體質(zhì)量(20～25) g，購自南京模式動物研究所，許可證編號：SYXK(蘇)2016-0012。小鼠飼養(yǎng)在江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院動物中心的SPF級動物飼養(yǎng)屏障環(huán)境中，環(huán)境濕度維持在50%，溫度保持在25 ℃左右，自由進(jìn)食飲水，通過燈光控制系統(tǒng)，使其在每天50%光照時間與50%黑夜時間交替中生活。將30只小鼠隨機均分成兩組，各3籠，每籠5只。

1.1.2試劑 NaCl(10019318)，購自滬試公司；甘露醇(BL-SJ-0243)，購自上海博光生物科技有限公司；ECM培養(yǎng)基(1001)，購自Lonza公司；HBSS(C0218)，購自碧云天公司；膠原蛋白酶(C9891)、TRPV4激動劑GSK1016790A(G0798)、TRPV4抑制劑HC067047(4100/50)，購自Sigma公司；Fluo-4(F14201)、DAF-FM DA(D23844)，購自Invitrogen公司。

1.1.3儀器 低速離心機、生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1原代胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 利用頸椎脫臼法使小鼠迅速死亡，分離小鼠胸主動脈血管于無菌PBS中。將胸主動脈血管于生物安全柜中剪成3 cm左右的小片段，然后將其轉(zhuǎn)移至10 mL無菌離心管中，離心管中含5 mL消化液(PBS ∶膠原酶=500 ∶1)。在37 ℃震蕩水浴鍋中快速消化15～20 min。然后將液體轉(zhuǎn)移至10 mL無菌離心管中，1 200 r·min-1離心5 min，小心吸出上清并棄之，加入1 mL ECM完全培養(yǎng)基重懸，將混懸液轉(zhuǎn)移至6孔板中，補加1 mL ECM完全培養(yǎng)基，輕輕搖晃混勻，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 h后待胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞貼壁后，用無菌PBS洗滌3～5次，并加入2 mL ECM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2高鹽細(xì)胞模型的誘導(dǎo) 稱取NaCl粉末溶于ECM完全培養(yǎng)基中，使其濃度為60 mmol·L-1，用0.22 μm的無菌濾頭過濾。將6孔板中的胸主動脈血管原代內(nèi)皮細(xì)胞胰酶消化，1 200 r·min-1離心5 min，用60 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基重懸于激光共聚焦小皿中培養(yǎng)48 h。

1.2.3Ca2+標(biāo)記 將分離得到的細(xì)胞鋪于共聚焦小皿中培養(yǎng)48 h，HBSS洗滌3遍。用HBSS配制Fluo-4(母液：625 μmol·L-1)，按1 ∶200稀釋，每皿加入200 μL于培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，然后將工作液棄去，HBSS洗滌3遍，加入800 μL HBSS并在共聚焦顯微鏡下觀察。配制GSK1016790A(TRPV4激動劑)為1 ∶200(工作濃度為1 μmol·L-1)，待調(diào)好焦距拍攝1 min左右后，加入200 μL工作液觀察熒光的變化。

1.2.4NO標(biāo)記 將分離得到的細(xì)胞鋪于共聚焦小皿中，用HBSS配制DAF-FM DA工作液為1 μmol·L-1，將共聚焦小皿用HBSS溶液洗滌3遍，每皿加入200 μL DAF-FM DA工作液，于培養(yǎng)箱中避光孵育10 min，然后將工作液棄去，HBSS洗滌3遍，加入1 mL HBSS在共聚焦顯微鏡下觀察熒光。

2 結(jié)果

2.1 抑制TRPV4后胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流下降用TRPV4的抑制劑HC067047(10 μmol·L-1)預(yù)孵育胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞1 h后，F(xiàn)luo-4鈣離子熒光探針標(biāo)記30 min，于共聚焦顯微鏡下觀察，待拍攝1 min后加入TRPV4的激動劑GSK1016790A，發(fā)現(xiàn)對照組鈣離子濃度明顯增加，180 s時對照組鈣離子濃度達(dá)到最大值，而HC067047組鈣離子濃度無明顯變化(Fig 1A)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，對照組相對最大熒光值強度明顯高于HC067047組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 1B)。表明抑制TRPV4后，胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流下降。

2.2 高鹽抑制胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TRPV4介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流通過Fluo-4鈣離子熒光探針對胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，在共聚焦顯微鏡下拍攝1 min后，加入TRPV4的激動劑GSK1016790A，發(fā)現(xiàn)180 s左右時對照組與高鹽誘導(dǎo)組鈣離子濃度均達(dá)到最大值，但高鹽組上升幅度明顯低于對照組(Fig 2A)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，高鹽組的相對最大熒光值明顯低于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 2B)。同滲透壓甘露醇組(120 mmol·L-1)與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明高鹽導(dǎo)致TRPV4介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流減少，并且其作用與滲透壓無關(guān)。

2.3 抑制TRPV4后胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成下降用TRPV4的抑制劑HC067047(10 μmol·L-1)預(yù)孵育胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞1h后，DAF-FM DA一氧化氮熒光探針對胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記10 min，在共聚焦顯微鏡下觀察，控制熒光強度相同的情況下，HC067047組明顯比對照組暗(Fig 3A)。結(jié)果統(tǒng)計顯示，HC067047組的熒光值明顯低于對照組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 3B)。表明抑制TRPV4后，胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成減弱。

Fig 3 Decreased production of NO in thoracic aorticendothelial cells after inhibition of TRPV4

2.4 高鹽抑制胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成通過DAF-FM DA NO熒光探針對胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，于共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，在相同的熒光強度下，對照組明顯比高鹽組亮(Fig 4A)。統(tǒng)計顯示，高鹽組的熒光值明顯低于對照組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 4B)。同滲透壓甘露醇組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明高鹽導(dǎo)致NO的生成減少，并且其作用與滲透壓無關(guān)。

Fig 4 NO production inhibited by high saltin thoracic aortic endothelial cells

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞中，TRPV4對調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能穩(wěn)態(tài)非常重要。TRPV4與TRPC1形成復(fù)合體是小動脈內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)答血流剪切力的關(guān)鍵分子[11]。NO通過cGMP/PKG負(fù)反饋調(diào)控通路，抑制TPRV4-TRPC1復(fù)合體的功能，進(jìn)而維持內(nèi)皮細(xì)胞的功能穩(wěn)態(tài)[12]。豬冠狀動脈平滑肌細(xì)胞和人內(nèi)乳動脈平滑肌細(xì)胞中，TRPV4-TRPC1-KCa1.1功能復(fù)合體在維持血管功能穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[13-14]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓病理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞中TPRV4-KCa2.3復(fù)合體解偶聯(lián)，其調(diào)節(jié)的血管內(nèi)皮舒張功能減弱是高血壓發(fā)生的起始因素。NOS的活性對于NO的生成以及在血管中的作用具有巨大的影響[15]。TRPV4與NO均參與血管功能的調(diào)節(jié)，但TRPV4對NO的影響還不夠詳細(xì)，因此，本實驗探究在高鹽模型下，TRPV4對NO產(chǎn)生的影響。本實驗研究結(jié)果表明，抑制TRPV4后，鈣離子內(nèi)流基本被廢除，NO的生成大大降低。高鹽誘導(dǎo)的胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞模型中，TRPV4介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流減少，從而抑制NOS的活性，進(jìn)一步引起NO生成的減少。NO是一種有效的血管擴張劑以及重要的信號分子，其在血液循環(huán)中充當(dāng)著重要的角色，高鹽下通過抑制TRPV4通道引起的NO生成的減少，在某種程度上為揭示高血壓形成原因提供了一個新的假想，為研究血管功能失衡提供了一個新的研究思路。

我們通過在ECM培養(yǎng)基中添加NaCl，使其濃度為60 mmol·L-1，將內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基換成該含鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，誘導(dǎo)形成高鹽模型模擬病理狀態(tài)。在該濃度下，細(xì)胞的形態(tài)與正常細(xì)胞類似，不會引起其形態(tài)的改變以及死亡。通過鈣離子熒光探針Fluo-4對鈣內(nèi)流研究發(fā)現(xiàn)，加入TRPV4激動劑GSK1016790A后可以增加鈣內(nèi)流，但高鹽組的幅度明顯低于對照組，從而導(dǎo)致NOS活性降低，進(jìn)一步導(dǎo)致NO的生成減少。通過DAF-FM DA對NO進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)相同熒光強度下，高鹽組的熒光明顯比對照組弱，進(jìn)一步佐證高鹽誘導(dǎo)會導(dǎo)致NO的生成減少。上述實驗結(jié)果與抑制TRPV4所得到的結(jié)果一致，因此，可以推斷高鹽誘導(dǎo)抑制TRPV4的功能，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞鈣內(nèi)流減少，NOS活性降低，NO的生成降低。但該研究還有待于深入，此研究著眼于高鹽模型下內(nèi)皮細(xì)胞中的TRPV4對NO生成的影響及其機制，為血管功能穩(wěn)態(tài)的失衡提供了新的研究思路及方向。

(致謝：本文實驗在江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院心血管研究室完成，感謝所有實驗參與人員的大力幫助！)