袁濱 柯麗娜 黃藝寧 張志鴻 連燕萍 張丹鳳

摘 要：【目的】準(zhǔn)確、科學(xué)地鑒定灰樹花菌株，明確其親緣關(guān)系?！痉椒ā坎捎棉卓购虸SSR分子標(biāo)記對(duì)供試的11個(gè)灰樹花菌株進(jìn)行鑒定和遺傳多樣性分析?！窘Y(jié)果】拮抗反應(yīng)表明，供試菌株之間拮抗作用有一定差異，根據(jù)拮抗反應(yīng)的有無，供試菌株分為4組。ISSR分子標(biāo)記分析表明，當(dāng)相似性系數(shù)達(dá)到0.87水平時(shí)，供試菌株聚成5組，第1組包括菌株1（石家莊灰樹花）、2（臺(tái)灰）、10（XG-W）、5（Gr0001+2）、6（CN）、7（雪圓）;第2組為菌株11（CN-9）;第3組為菌株4（Gr0003）;第4組包括菌株8（H）、9（Hokto）;第5組為菌株3（Gr20）。【結(jié)論】拮抗反應(yīng)與ISSR兩種方法結(jié)論較一致，推測(cè)石家莊灰樹花與臺(tái)灰，Gr0001+2、CN與雪圓，H與Hokto這3組菌株分別來源于同一個(gè)菌株，屬于同種異名現(xiàn)象Gr0003、H和Hokto親緣關(guān)系較遠(yuǎn);Gr20與其他菌株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：拮抗;ISSR技術(shù);灰樹花;鑒定;聚類分析

中圖分類號(hào)：S 646文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）04-393-07

Abstract： 【Objective】To reliably identify strains of Grifola frondosa and precisely determine the genetic relationship among them. 【Method】The identification and genetic diversity analysis on 11 strains of G. frondosa were carried out by the combined use of the antagonistic challenging test and ISSR. 【Result】The antagonistic test on the strains demonstrated apparent differences on their responses. Presence or absence of antagonism allowed the classification of the strains into 4 distinct groups. Meanwhile， from the ISSR analysis， when the similarity coefficient reached 0.87， the strains were clustered into 5 groups. They were Group 1 that included Strain #1 （Shijiazhuang ash tree flower）， Strain #2 （stage ash）， Strain #10 （XG-W）， Strain #5 （Gr0001+2）， Strain #6 （CN）， and Strain #7 （snow circle）; Group 2， Strain #11 （CN-9）; Group 3， Strain #4 （Gr0003）; Group 4， Strain #8 （H） and Strain #9 （Hokto）; and， Group 5， Strain #3 （Gr20）. 【Conclusion】It appeared that Strain #1 and Strain #2 belonged to a same species; so were Strains #5， Strain #6 and Strain #7， and Strains #8 and Strain #9. At the similarity coefficient of 0.8， Strain #4 could be clustered with Strain #8 and Strain #9 with slight differences indicating a distance on genetic relationship among them. Strain #3 had a lowest coefficient of 0.34， therefore， it was most remotely related to all.

Key words： antagonistic effect; ISSR; Grifola frondosa; identification; cluster analysis

0 引言

【研究意義】灰樹花Grifola frondosa又名栗蘑、貝葉多孔菌、千佛菌等，屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌屬[1-3]，是一種珍貴的藥、食兩用真菌?；覙浠ㄗ訉?shí)體肉質(zhì)鮮美，口感脆嫩可口，富含多種維生素、蛋白質(zhì)和氨基酸，且藥用價(jià)值較高，含有多種活性成分[4]，具有抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降低血脂等醫(yī)療保健作用[1，5-10]，是非常有市場(chǎng)前景的珍稀食用菌[11]。近年來灰樹花在我國栽培面積不斷擴(kuò)大，但由于起步較晚，生產(chǎn)中使用的品種主要來自野生馴化或引進(jìn)日本品種，存在適應(yīng)能力差、生物轉(zhuǎn)化率低、品種比較單一等缺點(diǎn)[12]。為了適應(yīng)不斷擴(kuò)大、多樣化的市場(chǎng)需求，亟需新的優(yōu)良的灰樹花品種。雜交育種作為食用菌常規(guī)育種的主要方法[13]，親本選擇是雜交育種最關(guān)鍵的因素。但現(xiàn)在市場(chǎng)上灰樹花品種較為混亂，有些食用菌制種戶，相互引種后，又冠上新名，導(dǎo)致灰樹花同種異名，同名異種現(xiàn)象普遍存在，這一方面嚴(yán)重?fù)p害栽培戶的生產(chǎn)積極性，另一方面也不利于科研工作者開展雜交育種工作。因此，收集鑒定主栽的灰樹花菌株，分析其親緣關(guān)系，為今后的雜交育種提供依據(jù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 【前人研究進(jìn)展】拮抗反應(yīng)是真菌體細(xì)胞不親和性的具體體現(xiàn)[14]，可用于鑒定食用菌品種遺傳差異，利用菌株之間的拮抗反應(yīng)判斷兩者的親緣關(guān)系。具有操作簡(jiǎn)單，快速的優(yōu)點(diǎn)[15]，但對(duì)于遺傳背景較相近的菌株難以鑒別[16]。如體細(xì)胞親和的菌株可能為同一菌株，也可能存在遺傳差異，表現(xiàn)為拮抗線弱或無。即兩個(gè)菌株沒有拮抗反應(yīng)，則不能確定是相同菌株。因此拮抗只能作為食用菌菌株鑒定的初步方法。而分子生物學(xué)方法能直接從 DNA水平上反映其遺傳關(guān)系，更客觀和準(zhǔn)確[17]。ISSR是以PCR技術(shù)為核心，基于簡(jiǎn)單重復(fù)序列擴(kuò)增多態(tài)SSR建立的一種分子標(biāo)記技術(shù)[18]，廣泛用于食用菌菌株鑒定、遺傳多樣性分析及雜交育種等方面[19]，ISSR技術(shù)結(jié)合了RAPD和SSR方法的優(yōu)點(diǎn)，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性高的特點(diǎn)[20]。王春暉等[21]等利用ISSR和RAPD標(biāo)記對(duì)8個(gè)灰樹花栽培菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，16個(gè)ISSR引物將8個(gè)菌株分為4個(gè)大類。溫志強(qiáng)等[22]利用RAPD、ISSR、SRAP等3種DNA分子標(biāo)記分別對(duì)不同來源的30個(gè)灰樹花菌株進(jìn)行鑒別，在D=0.77的相異系數(shù)水平上，可以將30個(gè)灰樹花菌株分為10個(gè)類群，其中包括6個(gè)單一類別和4個(gè)復(fù)合類群?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ISSR分子標(biāo)記在灰樹花菌株鑒定上有一定的應(yīng)用，但目前鮮見采用拮抗和ISSR-PCR相結(jié)合對(duì)灰樹花菌株進(jìn)行鑒定和遺傳多樣性分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用拮抗和ISSR-PCR相結(jié)合對(duì)收集的11個(gè)灰樹花菌株進(jìn)行鑒定和遺傳多樣性分析，以期更準(zhǔn)確、更科學(xué)鑒定收集的灰樹花菌株，確定其親緣關(guān)系，為雜交親本選配及今后的新品種的育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的灰樹花菌株11個(gè)，具體信息來源見表1。

1.2 試驗(yàn)試劑

DNA提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司;Taq酶、dNTPs、10×Buffer緩沖液、Mg2+等均購自TaKaRa公司（大連）;ISSR引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成;其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 L，121℃滅菌20 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 拮抗試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)，將活化后的供試菌株，轉(zhuǎn)接到同一平板上，按品字形接種3個(gè)不同菌株。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察不同菌株菌絲間的拮抗反應(yīng)情況。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 供試菌株DNA提取DNA提取采用試劑盒。

1.4.3 ISSR-PCR擴(kuò)增體系

選用20個(gè)ISSR引物對(duì)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增。引物信息具體見表2，ISSR-PCR擴(kuò)增體系見表3。

1.4.4 ISSR-PCR反應(yīng)程序及電泳

ISSR-PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，44-50℃退火45 s，72℃ 延伸1 min 循環(huán)數(shù)35個(gè)，最后72℃ 延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：取擴(kuò)增產(chǎn)物7 μL，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5 μg·mL-1 GoldviewTMDNA 染料），160 V恒壓1.5 h，紫外凝膠成像系統(tǒng)照像。

1.5 數(shù)據(jù)分析

拮抗反應(yīng)是根據(jù)NY/T1845-2010食用菌菌種區(qū)別性鑒定方法判斷。ISSR-PCR反應(yīng)分析是針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，將試驗(yàn)出現(xiàn)的穩(wěn)定性條帶記為1，無條帶記為0，構(gòu)建“0-1”矩陣表，利用公式[23]算出多態(tài)位點(diǎn)百分率P。用NTSYS-pc 2.0軟件進(jìn)行聚類分析，并形成供試菌株的遺傳聚類圖。

公式為：P=k/n （100%）。

式中，P為多態(tài)位點(diǎn)百分率，k為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)，n為位點(diǎn)總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的拮抗反應(yīng)

供試菌株有3種典型的拮抗反應(yīng)，如圖1所示。菌株1與菌株5無拮抗反應(yīng)，這兩個(gè)菌株與菌株3拮抗反應(yīng)強(qiáng)烈，表現(xiàn)為菌絲隆起。菌株8與菌株9無拮抗反應(yīng)，這兩個(gè)菌株與菌株4拮抗反應(yīng)明顯，表現(xiàn)為拮抗線。菌株2與菌株10拮抗反應(yīng)極其不明顯，這兩個(gè)菌株與菌株4拮抗反應(yīng)明顯，表現(xiàn)為溝狀。

根據(jù)拮抗反應(yīng)的有無，形成供試菌株間的拮抗反應(yīng)情況（表4）。由表4 可以看出，菌株 1、2、5、6、7、10、11兩兩之間沒有拮抗線或拮抗性反應(yīng)極不明顯，說明這些菌株之間親緣關(guān)系較近，分為第一組;菌株8與菌株9之間沒有拮抗線，但與其他菌株均有明顯拮抗線，分為第二組;菌株3、菌株4兩兩之間及與其他菌株之間均有明顯拮抗反應(yīng)，說明菌株3、菌株4親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，菌株3為一組，菌株4分為另外一組。綜上所述，通過拮抗反應(yīng)分析可以將11個(gè)灰樹花菌株分成 4 組。

2.2 供試菌株的ISSR多態(tài)性分析

試驗(yàn)選取能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定特異條帶、多態(tài)性好、條帶清晰的20條引物，分別為P1、P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P16、P17、P18、P19、P20、P23、P25、P26、P28。圖2為引物P1和P2擴(kuò)增供試菌株的指紋圖譜。20條引物對(duì)供試菌株均擴(kuò)增出穩(wěn)定的條帶，多態(tài)性條帶在8～18條，擴(kuò)增出的DNA大小在100～2 200 bp。20條ISSR引物對(duì)供試菌株共擴(kuò)增出260條穩(wěn)定性條帶，其中多態(tài)性條帶達(dá)234條，多態(tài)性比率為90.0%。

2.3 供試菌株聚類分析

從圖3可以看出，當(dāng)相似性系數(shù)達(dá)到0.87時(shí)，供試菌株聚成5組，第1組包括菌株1（石家莊灰樹花）、2（臺(tái)灰）、10（XG-W）、5（Gr0001+2）、6（CN）、7（雪圓）;第2組為菌株11（CN-9）;第3組為菌株4（Gr0003）;第4組包括菌株8（H）、9（Hokto）;第5組為菌株3（Gr20）。

供試菌株之間的遺傳相似系數(shù)在0.34～1.00，其中相似系數(shù)為1的有菌株1、2;菌株5、6、7;菌株8、9。菌株10與菌株1、2相似性系數(shù)為0.98。表明這幾組菌株之間親緣性非常近。菌株11與菌株1、2、10、5、6、7的相似性系數(shù)為0.76，菌株11與這幾個(gè)菌株有一定的差異性，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。菌株4與菌株8、9的相似性系數(shù)為0.84，菌株4與菌株8、9有一定的差異性，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。菌株3與其他菌株相似系數(shù)最小，為0.34，說明菌株3與其他菌株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的食用菌菌株鑒別主要采用形態(tài)特征觀察的方法[24]，由于在栽培過程中，子實(shí)體形態(tài)特征會(huì)受到環(huán)境條件、栽培管理技術(shù)等因素的影響，出現(xiàn)較大的差異，因此單純使用形態(tài)學(xué)指標(biāo)分類比較困難。拮抗反應(yīng)是體細(xì)胞不親和性的具體體現(xiàn)[25]，具有操作方便、易于觀察的特點(diǎn)。在本試驗(yàn)中，拮抗現(xiàn)象有隆起型、拮抗線、溝狀，拮抗反應(yīng)較明顯。菌株 1、2、5、6、7、10、11兩兩之間沒有拮抗線，說明這些菌株之間親緣關(guān)系較近;菌株8與菌株9之間沒有拮抗線，但與其他菌株均有明顯拮抗線;菌株3、菌株4兩兩之間及與其他菌株之間均有明顯拮抗反應(yīng)，說明菌株3、菌株4親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

分子標(biāo)記技術(shù)通過擴(kuò)增供試菌株相關(guān)基因片段，尋找差異基因，因此利用分子標(biāo)記對(duì)菌株進(jìn)行鑒定分類具有準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)[26]。ISSR技術(shù)大量應(yīng)用在食用菌遺傳多樣性分析、雜交育種、品種鑒定等方面。如張介馳等[27]采用ISSR鑒別27個(gè)東北地區(qū)黑木耳生產(chǎn)菌株， ISSR揭示的DNA指紋多態(tài)性高，可以有效快速準(zhǔn)確鑒別黑木耳生產(chǎn)菌株。秦蓮花等[28]結(jié)合ITS與ISSR技術(shù)，作為香菇生產(chǎn)菌株鑒別。因此本試驗(yàn)采用ISSR分子標(biāo)記的方法進(jìn)行供試菌株鑒定。本試驗(yàn)中，當(dāng)相似性系數(shù)達(dá)到0.87水平時(shí)，供試菌株聚成5組，說明供試菌株具有豐富的遺傳多樣性。

有研究結(jié)果表明采用拮抗分類鑒定結(jié)果與其他鑒別方法的結(jié)果吻合。如金針菇拮抗反應(yīng)分類與RAPD分析結(jié)果吻合[29]。拮抗反應(yīng)和RAPD在靈芝親緣關(guān)系的鑒定結(jié)論一致[18]。杏鮑菇[30]、姬菇[31]、姬松茸[32]、香菇[28]等也存在這樣的現(xiàn)象。本試驗(yàn)采用拮抗反應(yīng)和ISSR-PCR兩種方法綜合鑒定供試的11個(gè)灰樹花菌株。結(jié)果表明這兩種方法所得到的結(jié)果存在一致性。如菌株1、2、5、6、7、10這7個(gè)菌株之間沒有拮抗反應(yīng)，而在ISSR聚類分析時(shí)，相似性系數(shù)為0.96時(shí)，菌株1、2、10、5、6、7聚在一類，親緣關(guān)系較近，其中菌株1和菌株2，相似性系數(shù)為1，菌株10與菌株1、2相似性系數(shù)為0.98。菌株5和菌株6、菌株7相似性系數(shù)為1。而菌株3與其他所有菌株拮抗反應(yīng)非常強(qiáng)烈，在ISSR聚類分析時(shí)單獨(dú)聚為一類，且與其他菌株的相似性系數(shù)為0.34，遺傳距離最遠(yuǎn)。

但拮抗反應(yīng)和ISSR分子標(biāo)記分析還是有一定的差異，如在拮抗反應(yīng)中，菌株11與菌株1、2、5、6、7、10沒有拮抗線，說明菌株11與這幾個(gè)菌株間遺傳背景較相似，親緣關(guān)系較近。而在ISSR分子標(biāo)記中，在相似性為0.76時(shí)菌株11與菌株1、2、5、6、7、10聚在一起。說明拮抗反應(yīng)不能有效區(qū)分兩個(gè)在遺傳背景相似或親緣關(guān)系很近的菌株[16]，因此可以通過拮抗反應(yīng)進(jìn)行初步分類，再通過分子標(biāo)記的方法進(jìn)行深入研究。

綜合這兩種方法，推測(cè)菌株1（石家莊灰樹花）與菌株2（臺(tái)灰）為同一個(gè)菌株，屬于同種異名現(xiàn)象。推測(cè)菌株5（Gr0001+2）、6（CN）、7（雪圓）為同一個(gè)菌株，屬于同種異名現(xiàn)象。推測(cè)菌株8（H）、9（Hokto）為同一個(gè)菌株，也屬于同種異名現(xiàn)象。菌株3（Gr20）、菌株4（Gr0003）為不同菌株。單純依靠拮抗和分子標(biāo)記方法作為分類學(xué)分析是不全面的，試驗(yàn)結(jié)果還需要通過觀察子實(shí)體農(nóng)藝性狀及生理生化指標(biāo)進(jìn)一步驗(yàn)證上述幾組菌株是否為同種異名現(xiàn)象。

楊軍等[33]采用ISSR和RAPD兩種分子標(biāo)記的方法對(duì)供試的40株菌株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)利用兩種分子標(biāo)記比單獨(dú)使用分子標(biāo)記鑒定的結(jié)果準(zhǔn)確，菌株類別劃分更精細(xì)。王守現(xiàn)等[34]采用酯酶同工酶聚類分析，將6個(gè)灰樹花菌株分為3大類，RAPD和ISSR引物驗(yàn)證，其結(jié)果與酯酶同工酶分析的一致。因此可以進(jìn)一步采用其他分子標(biāo)記驗(yàn)證本試驗(yàn)結(jié)果。

在本試驗(yàn)中，菌株3與其他菌株差異非常大，有必要對(duì)其進(jìn)行ITS測(cè)序，判斷是否為灰樹花菌株。

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（責(zé)任編輯：林海清）