翁祖桐

摘 要：【目的】探討壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲快速生長的最適宜光照強度?！痉椒ā恳詨喜诵缕贩N申福2號自由絲狀體營養(yǎng)藻絲為培養(yǎng)材料，研究不同光照強度（10、20、40、80、100 μmol·photons m-2·s-1）對自由絲狀體營養(yǎng)藻絲生長、光系統(tǒng)PSⅡ最大量子效率、光合色素含量、光合作用及抗氧化酶活性的影響?！窘Y(jié)果】經(jīng)25 d培養(yǎng)后，壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的增重隨光照強度梯度增加而表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，其中80 μmol·photons m-2·s-1光照強度培養(yǎng)下的藻體增重最多，且光系統(tǒng)PSⅡ最大量子效率Fv/Fm值最高。葉綠素a、類胡蘿卜素、藻紅蛋白含量整體上隨光強的增加而逐漸降低，藻藍蛋白含量則在各組間差異不顯著。藻體CA和RubisCO酶活性均隨光強增加而呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢。其中，以40 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的酶活性最強，80 μmol·photons m-2·s-1次之。超氧陰離子自由基和SOD在不同光強下的活性隨光強增加呈現(xiàn)先減弱后增強的趨勢，80 μmol·photons m-2·s-1下培養(yǎng)的壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲這兩種酶的活性均最低，分別為最高活性試驗組的24.0%和22.9%?！窘Y(jié)論】在80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下，壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲增重最多，藻體最大量子效率Fv/Fm值最大，RubisCO和CA活性較強，超氧陰離子和SOD活性最低，該光照強度最有利于壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的快速增殖。

關(guān)鍵詞：壇紫菜;自由絲狀體;光照強度;生長;生理指標

中圖分類號：S 968.43文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）04-488-07

Abstract：【Objective】Intensity of LED light for optimal growth of free-living conchocelis of Pyropia haitanensis （FCP） was studied.【Method】The effects of varied light intensities （i.e.， 10， 20， 40， 80 or 100 μmol ·photons m-2·s-1） using LED on the growth， maximal quantum efficiency （Fv/Fm） on PS II， content of photosynthetic pigments as well as the photosynthesis and antioxidant enzymes of Shenfu No.2， a new cultivar of P. haitanensis， were determined.【Result】After 25 d of culturing， the weight of algae increased with increasing intensity of illumination and peaked when 80 μmol·photons m-2·s-1 was applied. As the weight reached the maximum， the Fv/Fm on PS II was also at its highest level. On the other hand， the contents of chlorophyll a， carotenoids， and phycoerythrin decreased gradually as the light intensity increased. No significant differences on phycocyanin among the groups were observed. The greatest activities of CA and RubisCO in the algae were observed under 40 μmol·photons m-2·s-1 followed by 80 μmol·photons m-2·s-1 treatment before a decline. Upon an increase on light intensity， the activities of superoxide anion radicals and SOD decreased to the lowest level under 80 μmol·photons m-2·s-1 and then raised again. 【Conclusion】 The vegetative filaments of FCP cultured under 80 μmol·photons m-2·s-1 light appeared to render the highest algae growth rate and Fv/Fm， lowest activities of superoxide anions and SOD， and strongest activities of RubisCO and CA.

Key words： Pyropia haitanensis; free-living conchocelis; light intensity; growth; physiological characteristics

0 引言

【研究意義】壇紫菜Pyropia haitanensis在系統(tǒng)分類上屬于紅藻門，原紅藻綱Protoflorideae，紅毛菜目Bangiales，紅毛菜科Bangiaceae，Pyropia屬[1]，廣泛栽培于我國福建、浙江、廣東等沿海地區(qū)，其年產(chǎn)量占全國紫菜年總產(chǎn)量的3/4以上。隨著壇紫菜優(yōu)良品種培育工作的不斷深入，許多新品種（系）都開始采用自由絲狀體采苗的育苗工藝[2-4]。以壇紫菜自由絲狀體為種源，可保持新品種（系）的遺傳穩(wěn)定，防止因其他外源種質(zhì)混入而引起的種質(zhì)退化。因此，通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，短時間內(nèi)培養(yǎng)出豐富優(yōu)質(zhì)的壇紫菜良種的自由絲狀體，對實現(xiàn)壇紫菜的良種化生產(chǎn)至關(guān)重要?！厩叭搜芯窟M展】目前有關(guān)壇紫菜自由絲狀體生長發(fā)育的生態(tài)因子研究，主要集中在光照[5-7]、溫度[5]、鹽度和營養(yǎng)鹽供給水平[6]等方面。光是光合生物進行光合作用的能量來源，是大多數(shù)生物賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)。光照強度是光的一個重要屬性，不同光照強度會對植物體生長、發(fā)育產(chǎn)生不同程度的影響[8-9]。相關(guān)研究表明，在弱光下，許多藻類會增加藻膽蛋白及光合色素含量，有效收集光合作用所需的光能，而當光照強度加強時，捕光色素比例降低，減少光吸收，進而保護細胞[10]。不同光照強度還會影響藻類光合過程的關(guān)鍵限速酶活性[11]，并改變光系統(tǒng)活性[12-13]?！颈狙芯壳腥朦c】紫菜葉狀體通常具有較高的光飽和點[14]，絲狀體較葉狀體卻對光強更為敏感，相關(guān)的壇紫菜自由絲狀體培養(yǎng)大多數(shù)處在較低的光照強度（20、27、40 μmol·photons m-2·s-1）下[5-6]，而在高光強下（156 μmol·photons m-2·s-1）絲狀體光系統(tǒng)PSⅡ的電子傳遞速率會明顯下降[15]。因此，在此基礎(chǔ)上，篩選出最適宜光強進行壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的快速增殖，不僅可以充分發(fā)揮營養(yǎng)藻絲的光適應(yīng)能力，還能夠提高其光能利用效率和生長速率，具有重要的實際生產(chǎn)意義。但有關(guān)絲狀藻絲營養(yǎng)增殖與光因子的關(guān)系卻鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以光照強度作為單一變量，研究了不同梯度的光照強度（10、20、40、80、100 μmol·photons m-2·s-1）的LED光源對壇紫菜新品種申福2號自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的特定生長率、PSⅡ最大光量子效率、主要光合色素含量及部分抗氧化酶活性等生理指標的影響，旨在篩選出最適宜的光照強度用于壇紫菜良種自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的快速擴繁。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以壇紫菜新品種申福2號自由絲狀體營養(yǎng)藻絲作為試驗材料[4]，材料保存于福建省大成水產(chǎn)良種繁育試驗中心的保種室內(nèi)，保存方法參照Kato等[16]的方法。

1.2 試驗方法

1.2.1 自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的同步化培養(yǎng) 同步化培養(yǎng)參考韓軍軍等的方法[7]。每5 d更換一半MES培養(yǎng)基[16]，直至培養(yǎng)至試驗所需的藻體生物量。

1.2.2 試驗光源設(shè)定與藻體培養(yǎng) 采用LED復合型白光源，所有光源安裝在同一培養(yǎng)架的不同培養(yǎng)層，通過調(diào)節(jié)各培養(yǎng)層的燈管數(shù)量和輻照高度，并采用PLA-20植物光照分析儀測定光照強度，使照射到培養(yǎng)瓶底部的光量子通量密度分別為10、20、40、80和100 μmol·m-2·s-1。取同等質(zhì)量（0.85±0.01）g預(yù)先同步化培養(yǎng)的壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲，轉(zhuǎn)入1 000 mL錐形培養(yǎng)瓶內(nèi)，將錐形瓶分別置于不同光強條件下充氣培養(yǎng)（大氣CO2濃度）。每組設(shè)置3個平行。培養(yǎng)條件為：光周期12L∶12D，溫度（24±0.5）℃，鹽度30。每隔5 d更換1次MES培養(yǎng)液，并稱量藻體鮮重，培養(yǎng)時間為25 d。

1.2.3 藻體特定生長率的測定 每5 d測定并計算各組樣品的特定生長率（Specific Growth Rate，SGR），其計算公式為：SGR（%）=100×（LnST-LnST-5）/5。其中，ST為第T天藻體鮮重，ST-5代表前一次稱量時的藻體鮮重。

1.2.4 PSⅡ最大量子效率和主要光合色素含量的測定 采用超便攜式調(diào)制葉綠素熒光儀MINI PAMⅡ（德國WALZ公司）測定藻體PSⅡ最大量子效率Fv/Fm，方法參考文獻[17]。稱量新鮮藻體100 mg，暗光于甲醇（100%）溶液中研磨粉碎。4℃避光過夜后離心（10 000 r·min-1，10 min），取上清液。之后用紫外可見分光光度計（UV-3200，日本島津公司）測定樣本的吸光度。葉綠素a（chlorophyll a，Chl.a）和類胡蘿卜素（carotenoid，Car）含量的測定分別采用Porra[18]和Parsons等[19]的方法。同時，稱量鮮藻100 mg，置于8 mL磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 6.5）中研磨粉碎，4℃避光過夜后離心（19 000 r·min-1，15 min），取上清液，參考Beer等[20]的方法計算藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）和藻藍蛋白（phycocyanin，PC）含量。

1.2.5 部分光合作用及抗氧化酶活性的測定 壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase，CA）活性的測定參照Haglund等[21]的方法。樣本的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose Bisphosphate Carboxylase，RubisCO）活性測定參照Ronan等[22]報道的非放射性微孔板法。所有處理樣品經(jīng)溫化孵育后用Infinite 200 Pro NanoQuant酶標儀（瑞士帝肯公司）測定其在450 nm處的吸光度，繪制標準曲線，并計算酶活力。

稱取新鮮藻體100 mg，按照重量（g） ∶體積（mL）=1∶9的比例加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液，研磨成勻漿后離心（10 000 r·min-1，4℃，10 min），取上清液，參照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定超氧陰離子自由基和超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計作圖采用Excel 2016。利用SPSS 23.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），差異顯著水平設(shè)置為P<0.05，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差的表示方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的生長曲線與特定生長率

在不同光照強度下，壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的增重呈現(xiàn)差異。如圖1所示，經(jīng)25 d培養(yǎng)后，光強80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的藻體增重最多，為5.29 g;10 μmol·photons? m-2·s-1藻體增重最少，僅為2.70 g。光強范圍為10～80 μmol·photons m-2·s-1藻體增重整體上趨于隨光強增強而增加，而光強增加至100 μmol·photons m-2·s-1時藻體增重下降。不同階段不同光強下壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的特定生長率（SGR）也存在差異（表1），在初始培養(yǎng)5 d后測定特定生長率，20 μmol·photons m-2·s-1下SGR最高，100 μmol·m-2·s-1最低，其他組間無明顯差異。培養(yǎng)10 d后，10 μmol·photons m-2·s-1下藻體的SGR逐漸降低，整體低于其他試驗組;20 μmol·photons m-2·s-1下絲狀體的SGR在5 d后一直保持在均衡狀態(tài);80 μmol photons·m-2·s-1下絲狀體營養(yǎng)藻絲的特定生長率相對于其他試驗組保持在中上水平，其中在15～25 d藻體的SGR較高。

2.2 主要光合色素及藻膽蛋白含量

如圖2所示，不同光強下壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的葉綠素a含量存在差異，呈現(xiàn)出隨光照強度增強而降低的趨勢。其中，10 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的藻體葉綠素a含量最高，為330.11 μg·g-1;100 μmol·photons m-2·s-1組最低，為270.05 μg·g-1，兩組間存在顯著差異（P<0.05）。與葉綠素a含量的測定結(jié)果相類似，類胡蘿卜素含量總體上也隨光照強度增加而逐漸下降，但光強在10～80 μmol·photons m-2·s-1范圍內(nèi)差異不明顯，而當光強增加至100 μmol·photons m-2·s-1時，培養(yǎng)的藻體類胡蘿卜素含量顯著降低，含量為13.13 μg·g-1，約為20 μmol·photons m-2·s-1光強培養(yǎng)下的1/3（P<0.05）。藻體的藻紅蛋白含量也隨著光照強度增加而降低（圖3），10 μmol·photons m-2·s-1組含量最高，為61.36 mg·g-1，100 μmol·photons m-2·s-1組含量最低，為38.60 mg·g-1。藻藍蛋白含量最低的是100 μmol·photons m-2·s-1組， 為3.63 mg·g-1，顯著低于其他各組。其他各組間藻藍蛋白含量無顯著差異。

2.3 PSⅡ最大量子效率Fv/Fm

如圖4所示，壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲在光強40 μmol·photons m-2·s-1下培養(yǎng)，PSⅡ最大量子效率Fv/Fm值最小，為0.668，顯著低于其他各試驗組。而80 μmol·photons m-2·s-1組的Fv/Fm值顯著高于其他各組，為0.741，是40 μmol·photons m-2·s-1組的1.11倍。10和20 μmol·photons m-2·s-1組間的Fv/Fm值無顯著差異。

2.4 光合作用及抗氧化相關(guān)酶活性

不同光強下培養(yǎng)藻體的CA和RubisCO活性如圖5所示，藻體CA和RubisCO的酶活性均隨光強增加而呈現(xiàn)先加強后減弱的趨勢。在低光強下（10～40 μmol·photons m-2·s-1）隨光強增加而提高，高光強（40～100 μmol·photons m-2·s-1）下則反之。其中以40 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的酶活性最強，分別較最低組增加19.39%和13.86%（P<0.05）。

不同光強下藻體的超氧陰離子自由基和SOD活性存在差異（圖6），且具有一定的規(guī)律性。在10 μmol·photons m-2·s-1光強培養(yǎng)下，藻體的超氧陰離子自由基活性最強，為157.01 U·L-1，隨著光強增加，其活性逐漸降低，當光強增至80 μmol·photons m-2·s-1時，其活性最低，為37.74 U·L-1。而在100 μmol·photons m-2·s-1下培養(yǎng)時，酶活性又增強至72.63 U·L-1。與超氧陰離子自由基相類似，藻體的SOD活性也隨光強增加而呈現(xiàn)先減弱后增強的趨勢。10 μmol·photons m-2·s-1光強培養(yǎng)下活性最強，為22.40 U·L-1。光強80 μmol·photons m-2·s-1下培養(yǎng)活性最低，為5.13 U·L-1。光強繼續(xù)增強至100 μmol·photons m-2·s-1時，酶活性又增強至9.23 U·L-1。

3 討 論

特定生長率（SGR）常用于衡量生物體生長狀況，SGR 值越大，說明生物體生長越快[23-24]。本研究的結(jié)果顯示，在光強10～80 μmol·photons m-2·s-1，壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲生長速度隨光照強度增加而加快，表現(xiàn)為SGR值升高。這與張前前等在硅藻研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致[25]。但是，隨著光照強度的持續(xù)增加，在100 μmol·photons m-2·s-1光強下培養(yǎng)的藻體生長減緩。這表明光照過強會對藻體的生長產(chǎn)生一定的抑制作用。正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)v/Fm是一個較穩(wěn)定的值，反映了植物體潛在的最大光合活性，與生長速度之間存在一定的相關(guān)性。本研究中，最大量子效率Fv/Fm值總體上隨光強增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中80 μmol·photons m-2·s-1光強培養(yǎng)下的Fv/Fm值最大，表明該光強下的植物潛在光合作用活性最強，這也與藻體SGR的結(jié)果相類似。與野生型壇紫菜絲狀體不同的是，野生型壇紫菜絲狀體營養(yǎng)藻絲在較高光強（78 μmol·photons m-2·s-1）下的實際量子效率（Y）和最大相對電子傳遞速率（rETRmax）均會顯著下降[15]，這可能與人工選育的新品種申福2號絲狀體種質(zhì)長期處在LED光照環(huán)境下擴大培養(yǎng)，營養(yǎng)藻絲自身賦予了更高的光適應(yīng)能力有關(guān)。

本研究中，壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲在弱光條件培養(yǎng)下，藻體葉綠素a、類胡蘿卜素及藻紅蛋白含量均表現(xiàn)出較高的水平，但當光照過強（100 μmol·photons m-2·s-1）時，則含量顯著性下降。藻藍蛋白含量在100 μmol·photons m-2·s-1組同樣最低，但其他各組間差異不明顯。以往的研究已經(jīng)證實，低光強下培養(yǎng)的海藻光合色素含量上升，光合作用單元和PSⅡ反應(yīng)中心數(shù)量會增多，這有助于藻體對光能的捕獲和傳導，而當光照過強時，藻體吸收的光能超過光合作用所需時，過多的光能使海藻處于脅迫狀態(tài)，藻體光合色素含量也相應(yīng)降低[15，26]，這是一種植物體常見的光適應(yīng)策略。

RubisCO和CA是植物光合作用和CO2濃縮機制中的兩個關(guān)鍵酶，可以調(diào)節(jié)光合反應(yīng)的CO2同化和光呼吸，并在一定程度上影響植物體的光合速率[27]。本研究中，這兩種酶的活性同樣隨光強遞增而呈現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢，其中，以40 μmol·photons m-2·s-1光強下活性最高，80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下也表現(xiàn)出較高的酶活性。超氧陰離子自由基是逆境脅迫下最早形成的自由基種類，過高的自由基含量往往會造成細胞質(zhì)膜損傷，引起膜系統(tǒng)的癱瘓，從而導致代謝功能喪失[28]。SOD是生物體細胞內(nèi)清除超氧陰離子自由基的一種特異酶，其活性與超氧陰離子自由基存在一定的相關(guān)性，當植物體受到環(huán)境脅迫時，往往會表現(xiàn)出較高水平的超氧陰離子自由基[29-31]。研究結(jié)果顯示，80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲的超氧陰離子和SOD活性最低，說明該光強培養(yǎng)下的壇紫菜絲狀體營養(yǎng)藻絲生長狀況良好，不存在典型的環(huán)境脅迫效應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究中，80 μmol·photons m-2·s-1培養(yǎng)下的壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)藻絲，在各試驗組中藻體的增重最多，最大量子效率Fv/Fm值最大，RubisCO和CA酶活性較強，超氧陰離子和SOD活性最低。這表明80 μmol·photons m-2·s-1是最有利于壇紫菜自由絲狀體營養(yǎng)增殖的光照強度。

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（責任編輯：林海清）