左一萌 石曉玲 潘曉梅 王歡 尹永得 董雪瀅 王超

[摘要]在甘肅省蘭州市黃河沿岸的土壤中分離出一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株1-1-1，對其進行生理生化特征鑒定、菌落形態(tài)鑒定，提取其基因組DNA，擴增16SrDNA，經(jīng)對比分析，建立系統(tǒng)進化樹。研究結(jié)果顯示，菌株1-1-1與標準地衣芽孢桿菌為一個類群，同源性高達99%，將其鑒定為地衣芽孢桿菌。再以2%幾丁質(zhì)膠體作為唯一碳源，對其產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的特性進行探究，結(jié)果表明，在培養(yǎng)溫度為35℃、pH值為8.0、最佳接種量為5%、2%幾丁質(zhì)膠體為唯一碳源時，該菌株產(chǎn)酶量最大，酶活力最大值為1.15U/mL。

[關(guān)鍵詞]幾丁質(zhì)酶;產(chǎn)酶工藝優(yōu)化;鑒定

中圖分類號：S917.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190518

幾丁質(zhì)是N-乙酰氨基葡萄糖聚合成的高分子多糖，大量存在于蝦殼、蟹殼和其它節(jié)肢動物外殼、低等植物（藻類）中。相關(guān)統(tǒng)計表明，每年在天然聚合物與含氮有機物中，幾丁質(zhì)產(chǎn)量均為第2，位于第1的分別是纖維素和蛋白質(zhì)[1]。Benecke[2]在研究幾丁質(zhì)芽孢桿菌時發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶（Chitinase），可水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰葡糖胺或單體糖苷。幾丁質(zhì)酶有著良好的抗菌與抑制腫瘤的作用，在醫(yī)藥行業(yè)被廣泛地應(yīng)用，在食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護等諸多領(lǐng)域幾丁質(zhì)酶也有良好的應(yīng)用。目前，酶解法是幾丁質(zhì)的最佳利用途徑，然而由于其多樣復(fù)雜、自然界純化得到的幾丁質(zhì)酶活性低等因素，幾丁質(zhì)酶并未真正實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化[3]。想要高效利用幾丁質(zhì)這一豐富的資源，分離篩選出高效產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株顯得十分重要。

本試驗擬在甘肅省蘭州市黃河沿岸區(qū)域的表層土壤中篩選幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生菌株，并對其進行生理生化分析和分子鑒定，對菌株產(chǎn)酶條件進行研究，以期為幾丁質(zhì)進一步的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 土壤樣品

蘭州市黃河沿岸區(qū)域表層5～10cm的土壤。

1.1.2? 培養(yǎng)基

（1）分離培養(yǎng)基。1.5 g的NaCl、0.3 g的KH2PO4、0.7 g的K2HPO4、0.02 g的FeSO4·H2O、0.5 g的MgSO4、20 g的瓊脂、250 mL的2%幾丁質(zhì)膠體，添加蒸餾水至1 000 mL，pH值調(diào)整為中性[4]。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基。5.0 g的NaCl、10.0 g的蛋白胨、500 mL的2%幾丁質(zhì)膠體，其他成分及用量同分離培養(yǎng)基，添加蒸餾水至1 000 mL，pH值調(diào)整為中性。（3）其他：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)）和LB培養(yǎng)基（菌種活化）。

1.2? 方法

1.2.1? 膠體幾丁質(zhì)的制備

將預(yù)先冷卻的300 mL濃鹽酸緩慢倒入含有20 g幾丁質(zhì)粉末的干燥燒杯中，用100 mL蒸餾水攪拌成糊狀，放入4 ℃冰箱中溶脹24 h后將混合液倒入大燒杯，加入蒸餾水攪勻[4]。在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min的離心機中離心10 min，棄上清液，水洗沉淀，反復(fù)離心、水洗至中性，蒸餾水定容至1 000 mL即可。

1.2.2? 產(chǎn)酶菌株的篩選

（1）初篩。取10 g樣品與90 mL無菌水混合制成土壤懸液，經(jīng)高溫處理后進行梯度稀釋，涂布在幾丁質(zhì)膠體為唯一碳源的平板上，在35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。當幾丁質(zhì)被水解后，挑取周圍產(chǎn)生透明圈的菌落，劃線純培養(yǎng)。（2）復(fù)篩。將上述純培養(yǎng)菌落接入種子培養(yǎng)基，將振動篩轉(zhuǎn)速調(diào)整到180 r/min，并在35 ℃條件下培養(yǎng)1 d后，轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基（接種量5%），同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每隔一定時間取上清測定酶活力并記錄[5]。

1.2.3? 標準曲線的繪制

蔡莉[6]研究了DNS試劑的制備。制備等濃度梯度的N-乙酰氨基葡萄糖溶液，各取1 mL，50 ℃保溫1 h，加入1 mL的DNS，煮沸顯色5 min，在冰水浴中冷卻后，測量540 nm波長處樣品的吸光值并繪制標準曲線。N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線見圖1。

1.2.4? 酶活力的測定

酶活力是指在50 ℃水浴中，每小時1 mL培養(yǎng)液分解幾丁質(zhì)生成1 mg的N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

DNS法：樣品以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，所得上清液即為粗酶液，取粗酶液0.5 mL，加入0.5 mL的pH值為6.81的磷酸緩沖液，再加入等體積的2%幾丁質(zhì)膠體，置于50 ℃水浴中靜置1 h，以5 000 r/min的速度離心10 min，在上清液中加入1 mL的DNS試劑，煮沸5 min[7]。冰水浴迅速冷卻后稀釋5倍，對照組是同條件下的滅活10 min的酶液，分別測量并記錄540 nm波長下各個樣品的吸光度，并根據(jù)圖1轉(zhuǎn)換酶活力。

1.3? 菌種鑒定

1.3.1? 結(jié)構(gòu)與形態(tài)特征

參照《微生物學實驗手冊》[8]，對1-1-1菌株的形態(tài)特征進行詳細觀察。

1.3.2? 16SrDNA基因擴增

使用細菌16SrDNA通用引物（上游5'-agaggtttg atggctag-3'，下游5'-gttaccttgttacgactt-3'）進行聚合酶鏈反應(yīng)，循環(huán)30次，獲得菌株16SrDNA，通過凝膠電泳分離擴增到的DNA片段，用試劑盒回收純化后送至專門機構(gòu)測序[9]。

1.3.3? 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用序列對比工具BLAST對其進行同源性分析、系統(tǒng)發(fā)育分析，并用MEGA 7.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌種的篩選

在35 ℃條件下，以膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的平板上培養(yǎng)2～5 d后，用透明圈法從樣品中初步分離出3株目標菌。其中1-1-1菌株的幾丁質(zhì)酶活性最高，選其為研究對象。幾丁質(zhì)酶水解圈見圖2。

2.2? 菌落的形態(tài)特征

該菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，菌株的菌落粗糙、不透明、黏附且延展。顯微觀察到該菌呈桿狀，細胞寬約為0.7 μm、長約為2.0 μm，革蘭氏染色呈陽性，有芽孢，且菌體形狀呈橢圓形或柱形。菌株培養(yǎng)3 d后菌落的顯微形態(tài)見圖3。

2.3? 1-1-1菌株與病原真菌的對峙實驗

番茄早疫病、棉花枯萎病、灰霉病均屬于真菌病害?，F(xiàn)研究1-1-1菌株對上述病原菌的抑制能力，分別接種1-1-1菌株與番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌、灰霉病菌對峙培養(yǎng)，取3種病原菌單獨培養(yǎng)的平板為對照，35 ℃培養(yǎng)3 d后觀察其抑菌情況[10]。1-1-1菌株與病原真菌的對峙實驗見圖4，結(jié)果顯示，該幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌株對三種病原真菌均有抑制作用，其中對灰霉病菌的抑制作用最強。

2.4? 1-1-1 16SrDNA擴增與序列分析

2.4.1? 菌株基因組DNA序列測定

用1%的瓊脂糖電泳法分離1-1-1菌株的基因組DNA，作為16SrDNA擴增的模板，測序得到1-1-1菌株的基因組DNA序列，具體見圖5。

2.4.2? 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

取Gen Bank數(shù)據(jù)庫中與1-1-1菌株基因序列相似度較高的種屬16SrDNA序列進行BLAST比較，用MEGA 7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，具體見圖6[11]。發(fā)育樹是無根樹，重復(fù)次數(shù)為1 000。序列對比后得知該序列與地衣芽孢桿菌序列相似度最高，為99.0%。按照16SrDNA在菌種鑒定中的要求，可以將本菌株與地衣芽孢桿菌視為同一個種，最終將1-1-1菌株鑒定為Bacillus licheniformis。

2.5? 菌株產(chǎn)酶條件探究

2.5.1? 接種量對酶活力的影響

單一變量法研究1%、3%、5%、7%和9%的接種量對酶活性的變化，結(jié)果顯示，酶的活性隨接種量的增加先增加后降低，最佳接種量為5%。

2.5.2? 培養(yǎng)時間對酶活力的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基以最佳接種量接入菌懸液。培養(yǎng)1 d后每隔24 h測一次酶活力[12]。結(jié)果顯示，1-1-1菌株產(chǎn)酶活力在培養(yǎng)48 h時達到最大值，后隨著培養(yǎng)時間先下降在第5 d時有緩慢回升又下降。

2.5.3? 產(chǎn)酶的最適pH值

當溫度為35 ℃、接種量為5%時：在pH值為5.0～7.0時，幾丁質(zhì)酶活力緩慢上升;pH值為7.0～8.0時，幾丁質(zhì)酶活力迅速上升;pH值為8.0以后，幾丁質(zhì)酶活力迅速下降;pH值在8.0處，幾丁質(zhì)酶活力達到最大值1.15 U/mL。

2.5.4? 膠體幾丁質(zhì)用量對產(chǎn)酶的影響

以膠體幾丁質(zhì)用量為變量，分別取15.5、16.5、17.5、18.5、19.5 mL，其他成分不變配培養(yǎng)基。接種后培養(yǎng)至48h測定其酶活力，使用Excel作圖。結(jié)果顯示，隨著膠體幾丁質(zhì)用量的增加，酶活力逐漸上升，在18.5 mL時上升至最大值，隨后迅速下降。1-1-1菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響條件見圖7。

3? 結(jié)? 論

幾丁質(zhì)在自然界大量存在，在幾丁質(zhì)酶的分解作用下產(chǎn)生的N-乙酰葡糖胺有多種生物活性，不僅可以促進腸道益生菌的繁殖、強化機體免疫力，還可以降血壓、降血脂，應(yīng)用前景十分廣闊[13]。但其生產(chǎn)成本頗高、價格貴，目前常用的濃鹽酸水解制備法對環(huán)境影響大、得率低。幾丁質(zhì)的酶解法作用條件溫和、環(huán)保，是制備幾丁寡糖的發(fā)展方向。

本試驗通過透明圈法分離出了一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的細菌，經(jīng)過生理生化鑒定1-1-1菌株為地衣芽孢桿菌。在其與多種病原真菌的對峙實驗中，該菌株表現(xiàn)出了對病原真菌良好的抑制作用，可用于生物防治，為農(nóng)業(yè)方面幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用提供借鑒。后采用單因素實驗探討了1-1-1菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的影響因素，研究發(fā)現(xiàn)pH值、碳源、接種量是影響菌株產(chǎn)酶性能的主要因素。尹璐等[14]研究表明，幾丁質(zhì)酶活力到達最大值的時間為4～8 d，本文篩選的1-1-1菌株從培養(yǎng)1 d后開始大量產(chǎn)酶，在48 h時達到最大值，說明該菌株有良好的產(chǎn)酶性能，可以提高產(chǎn)酶效率。產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌1-1-1菌株在溫度為35 ℃時，最佳接種量為5%、2%膠體幾丁質(zhì)最佳用量為18.5 mL、最適pH值為8.0，耐堿性，有良好的潛在利用價值。

參考文獻

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收稿日期：2019-04-26

基金項目：蘭州交通大學國家級創(chuàng)新訓練項目（201810732008）。

作者簡介：左一萌，女，本科在讀，研究方向為生物工程。