王金泉 周杰棟 李舒靜 金柔柔

摘要：目的：檢測藏紅花素對肝癌H22細(xì)胞小鼠移植瘤的作用。方法：28只腹股溝皮下接種H22移植瘤細(xì)胞后隨機(jī)分為低劑量組7只（3mg/ml）、中劑量組7只（6mg/ml）、高劑量組7只（9mg/ml）和生理鹽水對照組7只。于模型建立后每天每組分別灌胃不同劑量藏紅花素，處理后第7天眼球取血處死小鼠，摘取移植瘤、脾臟。計(jì)算抑瘤率、脾指數(shù)、血清作常規(guī)生化檢測，ELISA法檢測小鼠血清IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平，免疫組化分析脾組織中IL-4、IFN-γ以及腫瘤組織p53和STAT蛋白表達(dá)。結(jié)果：crocin對肝癌H22細(xì)胞小鼠移植瘤有抑制作用，低劑量組抑瘤率達(dá)28.45%。ELISA結(jié)果顯示IL-2水平明顯高于對照組，免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)藏紅花素處理后脾組織中IL-4、IFN-γ增多以及腫瘤組織p53表達(dá)增強(qiáng)和STAT蛋白表達(dá)減弱。結(jié)論：crocin能夠抑制肝癌H22細(xì)胞小鼠移植瘤的生長，作用的機(jī)制與增加IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ、p53表達(dá)以及抑制STAT蛋白表達(dá)減弱有關(guān)。

關(guān)鍵詞：crocin;肝癌;p53;STAT

【中圖分類號】R-03 ???【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ???【文章編號】2107-2306（2019）06-087-02

引言：藏紅花，又名西紅花，作為一味傳統(tǒng)的中草藥，在衛(wèi)生保健領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。現(xiàn)階段已有實(shí)驗(yàn)研究表明藏紅花的有效提取物藏紅花素（crocin）對于結(jié)直腸癌、舌磷癌等癌細(xì)胞生長繁殖均具有一定的抑制作用[1-2]。在本研究中，我們觀察到crocin對癌細(xì)胞的生長具有一定的負(fù)性調(diào)控效應(yīng)，且對腎臟沒有明顯的副作用。

1 材料與試劑

小鼠肝癌H22細(xì)胞;藏紅花素crocin（Sigma公司）;昆明小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有效公司），雌性鼠齡6周齡;兔抗鼠IL-4、IFN-γ、P53抗體，通用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒;小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γELISA檢測試劑盒;γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）測試盒、堿性磷酸酶（AKP）測試盒。

2 方法

2.1 動物分組、模型建立及動物給藥

將28只小鼠分為4組，每組7只。分別編為A、B、C、D組。A、B、C組分別為低中高劑量藥物實(shí)驗(yàn)組，D組為陰性對照組。用5ml注射器吸取腹水瘤小鼠的腹水，取下注射器，注入離心管中，按照1：3-1：4的比例加入生理鹽水或PBS，稀釋成瘤細(xì)胞懸液，1500rpm離心5min，棄上滑，加入適量PBS成生理鹽水，輕輕懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為3^10個/ml。取細(xì)胞懸液對A、B、C、D組小鼠于腹股溝皮下進(jìn)行注射，100ul/只。

（i）A、B、C組在腫瘤小鼠模型制備完成后每日分別灌胃3mg/ml、6mg/ml、9mg/ml的crocin1ml，持續(xù)一周;（ii）D組作為陰性藥物對照組在腫瘤小鼠模型建立后，每只小鼠灌胃生理鹽水1ml，持續(xù)一周。

2.2 觀察藥物的抑瘤作用

給藥完成后眼球取血處死小鼠，剝離腫瘤組織進(jìn)行稱重，并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組藥物抑瘤率。計(jì)算公式：抑瘤率=（1-實(shí)驗(yàn)組瘤體平均重量/對照組瘤體平均重量）*100%

2.3 脾指數(shù)測定

處死小鼠后取出完整脾臟，稱重并計(jì)算脾指數(shù)。計(jì)算公式：脾指數(shù)=脾重量（mg）/小鼠體重（g）。

2.6 ELISA法檢測小鼠血清IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平

小鼠眼球取血，離心后取血清，按試劑盒說明操作，基本步驟如下：按要求配制所需試劑，在樣品孔中依次加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，每孔加入50μl稀釋好的HRP標(biāo)記的檢測抗體，封閉，孵育，洗板，加入底物TMB溶液孵育后，每孔加入50μl終止液，在酶標(biāo)儀上450nm波長處測各樣品OD值。

2.7 免疫組織化學(xué)檢測（SP法）脾組織IL-4、IFN-γ和腫瘤組織p53蛋白的表達(dá)

4%中性甲醛固定組織、石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，按免疫組化步驟進(jìn)行SP法染色，檢測脾組織IL-4、IFN-γ和腫瘤組織p53蛋白表達(dá)。利用圖像分析軟件（PhotoshopCS6）對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果陽性信號進(jìn)行半定量分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有結(jié)果均采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P<0.05表示存在顯著性差異。

3 ?結(jié)果

3.1 對移植瘤重量的影響

治療期間小鼠進(jìn)食良好，出現(xiàn)體重減少，皮膚光澤度降低，行動遲緩等現(xiàn)象，局部注射藏紅花素沒有出現(xiàn)明顯毒副作用。治療結(jié)束后對照組小鼠瘤重明顯大于實(shí)驗(yàn)組，其差異均具有顯著性（P<0.05），其中低劑量組藥物對腫瘤生長的抑制性最顯著（表1）。

3.2 脾指數(shù)測定

治療結(jié)束后對照組小鼠脾臟重量及抑瘤率均小于對照組，且差異均具有顯著性意義（P<0.05）。其中低劑量組藥物促進(jìn)脾臟生長的作用在三組實(shí)驗(yàn)組中最強(qiáng)，其相應(yīng)的脾指數(shù)也最高（表2）。

3.3 ELISA法檢測小鼠血清IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平?ELISA測定血清細(xì)胞因子水平后，發(fā)現(xiàn)低劑量組IL-2表達(dá)水平顯著高于模型組（P<0.05），在中、高劑量組也升高較明顯，暗示了crocin可以增強(qiáng)機(jī)體免疫水平。

4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：脾組織中IL-4、IFN-γ主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，陽性細(xì)胞胞漿被染成棕黃色，P53抗原表達(dá)于移植瘤H22細(xì)胞胞漿和胞核中，陽性細(xì)胞被染成棕黃色。運(yùn)用圖像分析軟件對陽性細(xì)胞胞漿平均灰度值進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示處理組IL-4、IFN-γ和p53表達(dá)水平低于對照組，其差異具有顯著性意義（P<0.05），提示藏紅花素具有下調(diào)IL-4、IFN-γ和p53表達(dá)的作用。5 討論

本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠肝癌H22細(xì)胞移植瘤模型，觀察藏紅花素的對腫瘤的負(fù)性調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)藏紅花素不僅能夠抑制移植瘤細(xì)胞的生長，而且在用藥期間小鼠生長狀態(tài)良好，無死亡現(xiàn)象發(fā)生，且各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)正常，提示crocin對心肝腎等重要臟器無明顯的損害作用。我們同樣采用口服灌胃的方式，在經(jīng)過藥物crocin治療后實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤的重量明顯小于對照組，其差異具有顯著性（P<0.05），且在低劑量組藥物的抑瘤效果最為顯著。此結(jié)果提示藥物crocin對肝癌的生長和繁殖有較強(qiáng)的負(fù)性調(diào)控作用，且3mg/ml左右的濃度其效果最為顯著。

在本次實(shí)驗(yàn)中我們可見STAT在對照組中有表達(dá)，但是在crocin低劑量處理組中幾乎找不到表達(dá)陽性的細(xì)胞，這強(qiáng)烈暗示著crocin在抗肝癌方面有極大的潛力。

參考文獻(xiàn)

[1]. Aung， H.H.， et al.， Crocin from Crocus sativus possesses significant anti-proliferation effects on human colorectal cancer cells. Exp Oncol， 2007. 29（3）： p. 175-180.

[2]. Jun， S.， et al.， Crocin inhibits proliferation and nucleic acid synthesis and induces apoptosis in the human tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113. Asian Pac