馬甜 龔含情 陳建波 羅永婷

摘要：本文研究了在2.0、3.5、4.5、7.4、8.8五種pH值條件下特拉匹韋與人血清白蛋白的相互作用。結(jié)果表明：pH值為7.4（即生理?xiàng)l件下）時(shí)，結(jié)合常數(shù)K出現(xiàn)最大值，由此可見pH7.4是特拉匹韋與人血清白蛋白相互作用的最適pH值。

關(guān)鍵詞：特拉匹韋;人血清白蛋白;pH

【中圖分類號(hào)】R-01 ???【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ???【文章編號(hào)】2107-2306（2019）06-074-02

1 引言

血清白蛋白（Serum ?albumin，SA）作為脊椎動(dòng)物血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，是血液系統(tǒng)的重要組成部分，它具有結(jié)合與運(yùn)輸內(nèi)源性物質(zhì)、維持血液膠體滲透壓及物質(zhì)交換、 自由基清除、抗凝血及抑制血小板功能、影響微管滲透性等生理功能。

特拉匹韋是治療慢性丙型肝炎病毒感染的一個(gè)新大陸，能夠通過抑制NS3/4蛋白酶，攻擊HCV來阻斷病毒復(fù)制，在體內(nèi)和體外都有抗HCV基因的活性。目前，特拉匹韋已經(jīng)成為一個(gè)能夠?qū)χ委熓〉谋位颊弋a(chǎn)生療效的藥物，它的安全性高、用藥時(shí)間短，能夠減少長期用藥帶來的不良反應(yīng)。

本文探討了人血清白蛋白 （Human serum albumin， HSA） 在不同pH環(huán)境下與特拉匹韋的結(jié)合情況，比較了不同pH環(huán)境對(duì)二者結(jié)合程度的影響，提出理論最適pH條件，為特拉匹韋在臨床的研究提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1試劑與儀器

人血清白蛋白（純度≥98.0%，上海源聚生物科技有限公司產(chǎn)品），特拉匹韋（純度≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品），氯化鈉，氫氧化鈉，Tris，鹽酸均為分析純?cè)噭?/p>

ZD-2pH計(jì)，DK-S24電熱恒溫水浴鍋，Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)，AL104電子分析天平。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

用Tris和鹽酸配成濃度為0.05mol/L、pH分別為2.0、3.5、4.5、7.4、8.8的 Tris-鹽酸緩沖液，其中，用濃度為0.1mol/L的氯化鈉維持溶液離子強(qiáng)度。用配制好的不同的pH緩沖液分別配制人血清白蛋白與特拉匹韋濃度比依次升高的溶液，濃度比分別為1：0、1：5、1：9、1：13、1：17、1：21。將溶液置于298K的恒溫水浴鍋中放置一段時(shí)間后，取出進(jìn)行熒光測定。熒光光譜的測定：設(shè)置激發(fā)波長為280nm，發(fā)射和激發(fā)狹縫為5nm，掃描300～500nm內(nèi)蛋白的發(fā)射光譜。探究不同pH條件對(duì)特拉匹韋與人血清白蛋白的相互作用的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 pH7.4時(shí)特拉匹韋對(duì)人血清白蛋白熒光發(fā)射光譜的影響

5、9、13、17、21. ?T=298K， pH=7.4.

圖1顯示的是生理?xiàng)l件pH 7.4時(shí)的熒光光譜圖。隨著特拉匹韋濃度的增加，人血清白蛋白在最大熒光發(fā)射波長（λem） 341nm處的相對(duì)熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，同時(shí)熒光峰位略有紅移，說明特拉匹韋對(duì)人血清白蛋白的熒光有猝滅作用， 且會(huì)使人血清白蛋白的疏水性減小，極性增加。二者存在著相互作用。

3.2不同pH條件下下特拉匹韋和人血清白蛋白的相互作用

本實(shí)驗(yàn)選取分別在2.0、3.5、4.5、8.8四種pH環(huán)境，且溫度恒定為298K的條件下，通過pH對(duì)結(jié)合反應(yīng)的影響的光譜圖來判斷不同pH值對(duì)特拉匹韋和人血清白蛋白相互作用的影響.圖2為不同pH條件下特拉匹韋與人血清白蛋白相互作用的熒光發(fā)射光譜圖。

（1） C（HSA）=1×10?mol/L ，（2-6）C （telaprevir） /C（HSA）：5、9、13、17、21.

由圖2可知，特拉匹韋與人血清白蛋白結(jié)合的熒光峰隨著pH條件的變化而略微移動(dòng)，熒光強(qiáng)度也發(fā)生有所不同的變化，這說明，不同pH影響著特拉匹韋與人血清白蛋白的相互作用。

假設(shè)蛋白質(zhì)與藥物相互作用存在單一結(jié)合位點(diǎn)的情況，應(yīng)用方程（公式（1）），可計(jì)算特拉匹韋和人血清白蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)。

?

其中，F(xiàn)為人血清白蛋白的初始熒光強(qiáng)度（即未加特拉匹韋時(shí)蛋白的熒光強(qiáng)度）;F為特拉匹韋-人血清白蛋白體系的熒光強(qiáng)度;[Q]為特拉匹韋的最終體系濃度。根據(jù)對(duì)作圖，根據(jù)直線斜率可以求得特拉匹韋和人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)K。圖3為不同pH條件下特拉匹韋和人血清白蛋白結(jié)合位點(diǎn)的雙對(duì)數(shù)圖，根據(jù)圖中直線的斜率，由公式（1）計(jì)算求得結(jié)合常數(shù)K于表1中。

由表3數(shù)據(jù)可知，特拉匹韋與人血清白蛋白的結(jié)合可在不同pH環(huán)境下進(jìn)行，結(jié)合常數(shù)隨pH值的變化而發(fā)生改變，這是可能是因?yàn)椴煌膒H值環(huán)境影響了蛋白自身的構(gòu)象，或者影響了特拉匹韋與蛋白質(zhì)帶電的情況。同時(shí)，由表1數(shù)據(jù)可知，當(dāng)pH為7.4時(shí)，特拉匹韋與人血清白蛋白結(jié)合常數(shù)最大，這說明，pH7.4是特拉匹韋與人血清白蛋白結(jié)合的最適pH，也即生理環(huán)境的pH是特拉匹韋與人血清白蛋白結(jié)合的最適pH。

4 結(jié)論

本文運(yùn)用熒光光譜法研究了特拉匹韋與人血清白蛋白的相互作用。求出特拉匹韋和人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)，直觀反應(yīng)并探討了不同pH值對(duì)特拉匹韋和人血清白蛋白相互作用的影響。由表中數(shù)據(jù)可知，特拉匹韋和人血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)較大，說明兩者有較強(qiáng)的結(jié)合作用。推測人血清白蛋白起到儲(chǔ)存和運(yùn)輸特拉匹韋的作用，并且參與機(jī)體的血液循環(huán)至作用部位。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同pH值條件下，特拉匹韋均能與人血清白蛋白結(jié)合，但結(jié)合常數(shù)不同，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在不同pH值條件下的分子構(gòu)象發(fā)生了改變或由于不同pH值下，特拉匹韋的解離度相同引起蛋白質(zhì)帶電不同進(jìn)而可能影響到反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)。在四種pH值條件下，pH值為7.4（即生理?xiàng)l件下）時(shí)，結(jié)合常數(shù)Ka出現(xiàn)最大值，由此表明pH 7.4是特拉匹韋和與人血清白蛋白相互作用的最適pH值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可對(duì)特拉匹韋和人血清白蛋白相互作用的作用機(jī)理研究、臨床研究和生物工程等領(lǐng)域提供重要的理論參考。

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基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21303105）資助