袁媛 陳志

摘要：miRNA是參與機體許多生理功能調(diào)控的重要因素之一。本研究以miR- 145為研究對象，旨在通過三個靶基因預(yù)測軟件（rruRanda、PicTar及TargetScan）進行miR-145的靶基因的預(yù)測，以此來得到miR-145可能靶向FSCN1基因的結(jié)論。通過實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測和雙熒光素酶報告試驗多重驗證篩選miR-145靶基因。研究發(fā)現(xiàn)：在細胞水平中，miR-145的過表達會導(dǎo)致FSCN1的mRNA顯著下調(diào)，當(dāng)miR- 145被抑制表達的時候，會導(dǎo)致FSCN1的mRNA水平顯著上調(diào)。此外，熒光素酶報告試驗顯示，F(xiàn)SCN1基因的3'UTR存在著miR-145的靶向結(jié)合位點，其在miR- 145的作用下可顯著下調(diào)FSCN1活性。研究結(jié)果將明晰miR-145通過FSCN1來發(fā)揮生物學(xué)功能，為探索人類及動物調(diào)控機理提供了可靠的參考價值。

關(guān)鍵詞：miR-145;FSCN1;靶基因鑒定;熒光素酶報告試驗

miRNA （MicroRNA）是長度約為22個核苷酸，且物種之間有著較高保守性的非編碼RNA。在動物中，miR-NA調(diào)控靶基因表達的典型模式是通過微小核糖核蛋白復(fù)合體（miRNAP）結(jié)合在靶基因mRNA 3'UTR，以完全堿基配對或不完全堿基配對的方式識別靶基因上的miRNA識別位點（MREs），導(dǎo)致靶基因的翻譯抑制或者mRNA的降解。有研究報道，人類基因組可轉(zhuǎn)錄上千條miRNA，且超過60%的編碼蛋白的基因受到miRNA的調(diào)控。miRNA的調(diào)控作用涉及有機體的各項生命活動，參與糖尿病、胰島素抵抗、脂代謝等多種生物學(xué)過程，研究結(jié)果顯示，miR-145對機體免疫有一定的功能和作用。但是關(guān)于miR-145在下游調(diào)控關(guān)系報道還較少。鑒于此，本研究使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)、qRT-PCR等技術(shù)證明，在293-T中探索miR- 145下游靶基因，為探索動物和人類生理功能調(diào)控提供了可靠的參考價值。

一、材料和方法

（一）材料

293-T細胞（揚州大學(xué)）、胎牛血清澳洲血源（Gibco： 10099141）、Pierce⑩BCA Protein Assay Kit （Ther-mo，美國）、Anti-FSCNI antibody（ ab-cam，英國）、MinuteTM總蛋白提取試劑盒（Invent，美國）、miR-145 mim-iCS和inhibitor （廣州銳博：R11053.4）、β—actin （13E5） rabbitmAb （CST，美國）。 （二）miR- 145的mimics和inhibi-tor轉(zhuǎn)染293-T細胞

由前期預(yù)實驗結(jié)果可知，miR-145 mimics的最佳轉(zhuǎn)染濃度為lOOnM，miR- 145 inhibitor轉(zhuǎn)染的最佳濃度為300nM。在鋪板24h并且細胞密度約為80%時進行轉(zhuǎn)染，37℃，5% CO2的狀態(tài)下培養(yǎng)48h。

（三）熒光定量PCR檢測表達量

miRNA表達量的檢測：對轉(zhuǎn)染細胞中的RNA提取之后，對總RNA中的miRNA進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫提供的miR- 145序列設(shè)計定量引物，引物序列為GTCCAGTTTTCCCAC-GAA，下游引物為通用引物，以U6作為內(nèi)參。

mRNA表達量檢測：按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄操作，根據(jù)NC-BI上牛FSCNI及內(nèi)參基因CAPDH的序列，設(shè)計熒光定量PCR引物（見表1）。

（四）miR- 145靶向FSCNI的雙熒光素酶報告基因驗證

使用miRbase在線軟件預(yù)測所有miR- 145的靶基因，將預(yù)測到的靶基因使用DAVID在線軟件進行分析。本研究構(gòu)建了FSCNI基因3·-UTR野生型的熒光素酶報告載體及其突變型的載體。FSCN1野生型目的基因帶Sacl和Xhol酶切位點及保護堿基的引物設(shè)計，用于載體的亞克隆，oligo序列如表2所示。

溶解oligo至50μM，而后選取同體積液體置于1.5ml的離心管中，配成oligo mix。將第一輪的PCR反應(yīng)產(chǎn)物當(dāng)做模板，利用oligo-1及oligo- 12進行第二輪的PCR擴增。繼而進行切膠回收目的基因片段，用Sacl及Xhol對FSCNI的野生型基因片段進行酶切，37C的溫度下進行2h的酶切。而后用Sacl及Xhol對慢病毒載體GP-miRCLO進行酶切，同樣是37℃的溫度下進行2h的酶切。以上的酶切產(chǎn)物經(jīng)過電泳以后，利用DNA凝膠回收試劑盒對回收FSCNI WT基因片段以及GP- miR-GLO進行回收。

將經(jīng)過雙酶切所得到的FSCNIWT基因片段及已經(jīng)線性化的載體，利用DNA T4 ligase連接，按照如下連接體系22℃連接2h。FSCNI突變型基因片段是運用突變PCR的方法設(shè)計突變引物，將靶位點序列突變成TCTGACA（見圖1）。在獲得FSCNI突變目的基因片段以后，后續(xù)的步驟與野生型載體的構(gòu)建相同。

試驗一共分成四組來進行：FSCNI WT+ miR- 145 mimic：

FSCNIWT+miR-145 mimic NC; FSCNI Mut+miR-145 mimic：FSCNI Mut+miR-145mimic NC，轉(zhuǎn)染后48h，將培養(yǎng)基吸出。每孔加入75μL的PBS以及75μL的luciferase底物，而后避光進行l(wèi)Omin的震蕩，再用酶標(biāo)儀來進行螢火蟲熒光素酶的熒光值的測定。加入75μL的Stop reagent，避光進行l(wèi)Omin的震蕩以后，用酶標(biāo)儀來進行海腎熒光素酶的熒光值的測定，并且計算出熒光比值。

二、結(jié)果與分析

（一）過表達及干擾miR- 145表達量的效果

在293-T細胞系中轉(zhuǎn)染miR- 145mimics之后，再進行熒光定量的檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的miR- 145要遠遠高于對照組，表達量的上調(diào)超過了114倍。說明本次設(shè)計合成的效果非常顯著，并且已成功轉(zhuǎn)染進293-T細胞系中發(fā)揮其作用。同樣，miR-145 inhibi-tor組的miR- 145表達量和對照組進行比較以后發(fā)現(xiàn)，降低也呈現(xiàn)了極為顯著的差異（見圖2）。

（二）熒光定量PCR結(jié)果表明miR-145對FSCNI的表達具有干擾作用

由圖3可以看出熒光定量PCR的結(jié)果，在293-T細胞系中轉(zhuǎn)染了miR-145 mimics以后，基因FSCNI的表達量發(fā)生了極顯著的下調(diào)。與之相反，293-T細胞系在轉(zhuǎn)染了miR-145 inhibi-tor干擾了miR- 145的功能之后，F(xiàn)SCNI的表達量發(fā)生了極顯著的上調(diào)。

（三）雙熒光素酶報告載體活性檢測結(jié)果

對所挑出的質(zhì)粒進行酶切鑒定，并且與未酶切的質(zhì)粒均進行凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，部分質(zhì)粒所對應(yīng)的克隆并非陽性，其余均為陽性克隆。FSCNI野生型載體陽性克隆的測序由蘇州吉瑪公司完成，其序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中牛FSCNI基因3'UTR進行對比以后，結(jié)果是一樣的，這表明野生型載體的構(gòu)建是成功。AACUGGA突變?yōu)門CTGACA，這表明成功構(gòu)建出了FSCNI基因的3'UTR突變型載體。

如圖4所示，與對照組進行對比以后發(fā)現(xiàn)，miR- 145 WT型載體和miR-145 mimics共轉(zhuǎn)染熒光素酶的熒光值僅為對照組的64% （P< 0.01）;而FSCNI Mut型載體和miR- 145 mimics共轉(zhuǎn)染熒光值差異并不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。由此表明，miR-145可以靶向FSCNI的3'UTR并有效調(diào)控其表達。

三、討論

近年來，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，有些DNA序列不編碼任何蛋白質(zhì)分子，卻發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。RNAi的發(fā)現(xiàn)刷新了學(xué)者們對于RNA分子的調(diào)控基因的表達功能的認(rèn)識，可見小分子RNA是基因組內(nèi)的一個隱藏的信息層，有些學(xué)者將非編碼RNA稱為“暗物質(zhì)”。到目前為止miRNA，siRNA以及piRNA是非編碼RNA研究比較透徹的三個成員。siRNA是另一類小分子RNA，其生物合成的作用機制與miR-NA既有相同之處，也有獨特之處。本研究使用合成的siRNA作為抑制基因的試驗工具，不僅試驗效果明顯，而且試驗效率高。

在本研究中，三種在線預(yù)測軟件對bta- miR- 145的靶基因進行預(yù)測，而后將bta-miR-145 mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染至293T細胞系中，檢測預(yù)測的靶基因FSCNI的mRNA及蛋白表達的變化情況。bta-miR-145不管是過表達或者是抑制表達，F(xiàn)SCNI的mRNA均會發(fā)生明顯的改變，并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。由此看出，miR- 145以microRNA最通用的作用機制——翻譯抑制來對FSCNI的表達進行調(diào)控。而bta-miR-145的種子序列UUGACCU與牛FSCNI基因mRNA 3'UTR的一段序列AACUGGA匹配，結(jié)合先前從mRNA水平及蛋白水平分別驗證miR- 145過表達及干擾以后FSCNI分別產(chǎn)生了下調(diào)及上調(diào)表達的關(guān)系，由此來確定FSCNI是miR-145的靶基因。

雙熒光素酶報告基因檢測是鑒定miRNA與靶基因作用位點的最為常用的方法。因為在哺乳動物的細胞里并未發(fā)現(xiàn)存在內(nèi)源性螢光素酶，轉(zhuǎn)錄完成無需翻譯后的修飾，便可生成功能性的螢光素酶，因此，熒光素酶是一種極為理想的報告基因。螢火蟲熒光素酶是一種單亞基蛋白，其大小為6lkDa，作為報告基因，而海腎熒光素酶同樣是一種單亞基蛋白，其大小為36kDa，作為內(nèi)參校正基因。當(dāng)螢火蟲熒光素酶的活性測量完成以后，螢火蟲熒光淬滅，與此同時，海腎熒光素酶的發(fā)射會被激活，對兩者熒光值比值變化進行比較，以此可以確定miR-NA對于預(yù)測靶基因是否存在作用位點。一般情況下，如果野生型載體的熒光值下調(diào)30%以上，便可表明miR-NA對靶基因是具有調(diào)控作用的。本研究達到了40%的一個水平，可以說明miR-145靶向FSCNI。

四、小結(jié)

通過miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站以及轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可以篩選出幾個候選靶基因，通過實時熒光定量PCR和雙熒光素酶報告基因技術(shù)最終篩選出FSCNI與miR-145具有靶向關(guān)系。

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