劉曉麗 魏楠

摘要：通過構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌制作浸染液，實現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行目的基因的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化，將目的基因轉(zhuǎn)入到野生型擬南芥中。通過篩選和鑒定后，得到陽性的轉(zhuǎn)基因植株，最終得到純合T3代轉(zhuǎn)基因株系。后續(xù)可以通過對純合轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥進(jìn)行比較鑒定，即可推斷目的基因在擬南芥中的功能。

關(guān)鍵詞：擬南芥;遺傳轉(zhuǎn)化;實驗

一、實驗材料

（一）試驗材料

轉(zhuǎn)基因所需的菌株：農(nóng)桿菌EHA105;轉(zhuǎn)基因所需的模式植物：野生型擬南芥;轉(zhuǎn)基因所需的植物表達(dá)載體：pCAMBIA3301。

（二）試驗試劑

本實驗所需試劑主要有：Mu-rashige Skoog（MS）培養(yǎng)基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）;YEB、YEP液體培養(yǎng)基;YEP固體培養(yǎng)基;抗生素氯霉素（chlorampheni-col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）;草銨膦（phosphinothricin，PPT）;v/v（1：5）的次氯酸鈉溶液;瓊脂;蔗糖;表面活性劑silwetL-77等。

二、實驗方法

（一）超表達(dá)載體的構(gòu)建

采用質(zhì)粒小提試劑盒提取擴增、測序結(jié)果均正確無誤的pGM-T-目的基因的質(zhì)粒，具體步驟如下：第一，取2ml過夜培養(yǎng)的含目的基因的大腸桿菌Trans 5a轉(zhuǎn)化菌液，12，000rpm離心I min，吸除上清;第二，向留有菌體沉淀的離心管中加入150ul溶液P1（已加入RNase A和0.5%的TIANRed），使用渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀;第三，向離心管中加入150ul溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，使菌體充分裂解;第四，向離心管中加入350ul溶液P5，立即快速地上下顛倒12-20次，充分混勻，將出現(xiàn)絮狀沉淀，然后，12，000rpm離心2min;第五，將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，注意盡量不要吸出沉淀。12，000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液;第六，向吸附柱CP3中加入3001xl漂洗液PWT，12，000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液;第七，重復(fù)步驟六;第八，將吸附柱CP3放入收集管中，12，000rpm離心1rain，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除;第九，將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50ul洗脫緩沖液TB，12，000rpm離心30s將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。進(jìn)行質(zhì)粒提取后，用兩個內(nèi)切酶BglII和Pmll分別對pGM-T一目的基因的質(zhì)粒和pCAMBIA3301載體進(jìn)行雙酶切。加樣結(jié)束后，混勻，37℃酶切10h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，且對目標(biāo)片段及pCAMBIA3301骨架進(jìn)行膠回收。然后，通過連接酶對目標(biāo)片段和pCAMBIA3301骨架進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5a感受態(tài)，挑斑、搖菌，進(jìn)行菌液PCR檢測。挑取陽性pCAMBIA3301一目的基因克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗證和測序。測序正確后，陽性pCAM-BIA3301-目的基因克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHAl05感受態(tài)。

（二）轉(zhuǎn)化野生型擬南芥

1、野生型擬南芥的種植。野生型擬南芥的種植發(fā)苗有直播法和組培法。本實驗中采用組培法。將野生型擬南芥種子播種于MS固體培養(yǎng)基（不含抗生素）上，待長出四葉一心后移栽至花盆中，具體方法如下：第一，MS培養(yǎng)基準(zhǔn)備：M519粉末、蔗糖溶于去離子水中，終濃度分別為4.43g/L、30g/L，pH調(diào)節(jié)至5.8左右，后加入瓊脂（終濃度為7g/L），于121°C，高壓滅菌25min。待MS固體培養(yǎng)基冷卻到不燙手的程度后，無菌條件下，將其分裝到培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固待用。第二，種子消毒：（1）擬南芥種子（200～300粒）置于1.5mL的離心管內(nèi);（2）加入I mL75%乙醇溶液消毒I min;（3）吸出乙醇溶液，加入I mL的次氯酸鈉溶液（Naclo：ddH2O=l：5），振蕩洗滌8～10min，短暫離心;（4）在無菌條件下倒掉消毒液，后用無菌去離子水沖洗5-6次。第三，播種：移液槍吸取已消毒的種子于無菌濾紙條上，使用無菌牙簽點播至MS固體培養(yǎng)基上。株距1cm，行距1cm，播種完畢后，封口膜密封，4℃黑暗放置72h。第四，培養(yǎng)：平板至于培養(yǎng)室內(nèi)，光周期為23℃光照16h，20℃黑暗8h培養(yǎng)7-10d。待植株長至四葉一心時，移栽至營養(yǎng)土里。第五，移栽：營養(yǎng)土使用前需121°C，滅菌30min。冷卻后，營養(yǎng)土、蛭石按l：1的比例混勻，除去雜質(zhì)后裝進(jìn)小花盆放置于托盤內(nèi)，向托盤內(nèi)噴灑去離子水至表土濕潤為止。

2、浸染。浸染液的準(zhǔn)備，方法如下：（1）取檢測結(jié)果為陽性的保存于-80°C的農(nóng)桿菌菌液500uL于20mL含Chl（50mg/L）和Kan（50mg/L）的YEP液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng);（2）28°C，220rpm，培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁為止;（3）取以上菌液1mL于200mL含Chl和Kan的YEB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng);（4）28℃，220rpm，培養(yǎng)至菌液OD600值為1.0-1.2，不得超過1.2;（5）上述菌液置于4℃，5000rpm條件下離心10min，收集菌體;（6）使用轉(zhuǎn)化緩沖液重懸菌體，至使OD600為0.8左右，若OD值過高會影響擬南芥后期長勢，若OD值過低則會影響轉(zhuǎn)化效率;（7）菌液重懸后加入表面活性劑silwet L-77（每10mL菌液加入2uL silwet L-77），混勻靜置一段時間。采用浸染花序法浸染野生型擬南芥植株，方法如下：（1）當(dāng)野生型擬南芥植株抽薹3-8cm，即可進(jìn)行浸染;（2）選擇其中生長健壯、長勢相似的野生型擬南芥植株進(jìn)行浸染;（3）浸染前要對植株進(jìn)行初步的處理：剪去花葶上已經(jīng)開放的花朵和已經(jīng)形成的莢果，僅保留剛露白的花骨朵和花蕾;（4）提前向放置浸染植株的盒子內(nèi)鋪上一層濾紙，用噴壺打濕待用;（5）將剛露白的花骨朵和花蕾浸在浸染液中，定時5min;（6）植株上所有的花骨朵和花蕾浸染完全后，將植株傾斜放置于預(yù)先準(zhǔn)備的盒子內(nèi)，將盒子放置于20-25℃的環(huán)境中，暗培養(yǎng);（7）22～24h后取出暗培養(yǎng)的植株，轉(zhuǎn)至正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng);（8）為保證轉(zhuǎn)化效率，擬南芥培養(yǎng)一周左右，進(jìn)行第二次浸染?；跀M南芥的長勢，在其整個生長周期內(nèi)根據(jù)需要可浸染2～3次;（9）轉(zhuǎn)化后兩周左右，擬南芥結(jié)出大量莢果，使莢果自然成熟、干燥后，收取擬南芥種子即To代轉(zhuǎn)基因種子;To代種子置于干燥的環(huán)境下2周以上即可用于后期的篩選。

3、純合陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的篩選。直播法是將To代種子均勻撒入花盆營養(yǎng)土中，表面覆蓋一層薄土;保持營養(yǎng)土的濕潤;當(dāng)To代種子發(fā)芽長至3～4片真葉時噴灑50mg/L的PPT溶液;每天觀察幼苗生長情況，3-4h后根據(jù)實際情況繼續(xù)噴灑100mg/L或200mg/L的PPT溶液;最終存活的幼苗即為疑似陽性植株，取葉片進(jìn)行分子鑒定。收獲T1代種子進(jìn)行后續(xù)實驗。

4、陽性轉(zhuǎn)基因株系的鑒定。鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因To代植株，分株收獲得到T1代轉(zhuǎn)基因種子。組培法種植T1代轉(zhuǎn)基因種子，由孟德爾遺傳定律知T1種子的分離比，抗性植株：不抗植株=3：1，選擇抗性植株中葉片和根系均生長正常的幼苗移栽，分株收獲得到T2代種子;組培法種植T2代轉(zhuǎn)基因種子，其中，幾乎全部發(fā)芽的株系則為純合株系，留下此株系的T3代種子。

三、結(jié)果與分析

（一）目的基因轉(zhuǎn)化擬南芥

采用組織培養(yǎng)法進(jìn)行野生型擬南芥的種植。待植株長至四葉一心之后，挑選長勢一致的幼苗進(jìn)行移栽。待野生型植株抽薹3-8cm且剛剛開始開花時即可進(jìn)行浸染。待到莢果自然成熟、干燥后便收取得到To代種子。

（二）目的基因的陽性轉(zhuǎn)基因苗的篩選

1、To代的篩選。由于pCAM-BIA3301載體上含有Kan和PPT抗性位點，所以，采用了直播法和組培法進(jìn)行To代種子的種植。直播法是使用適當(dāng)濃度的PPT噴灑植株幼苗進(jìn)行篩選。組培法是將To代種子種植于含有Kan的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。陽性的轉(zhuǎn)基因植株可以在噴灑PPT后正常生長，也可在含有Kan的MS固體培養(yǎng)基上正常生長。組培法中，由于抗生素Kan影響葉綠體、線粒體蛋白的合成，固不含有抗性基因的植株在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)后黃化而死亡。直播法得到的疑似陽性植株和組培法中培養(yǎng)基上疑似陽性植株生長到一定階段后將其移栽至新的營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。得到的疑似陽性轉(zhuǎn)基因T。代植株，分株收獲，得到T1代種子。

2、To代的篩選。將T。代種子點播至含有Kan的MS固體培養(yǎng)基上，由孟德爾遺傳定律知T1代種子將按照3：1的比例發(fā)生分離，即有三分之一的T1代種子不能發(fā)芽。植株生長到一定階段后選擇移栽那些葉片嫩綠，根系發(fā)達(dá)的T1代幼苗。待莢果成熟后，分株收獲，得T2代種子。

3、T2代的篩選。T2代種子的篩選同上，由孟德爾遺傳定律知T2代種子一些株系按照3：1的分離比分離，而一些株系不發(fā)生分離即為純合株系。將篩選出的純和株系繼續(xù)培養(yǎng)，得到T3代種子進(jìn)行下一步的表型鑒定。

四、討論

在擬南芥的生長周期內(nèi)，溫度要保持在20～25℃。在苗期時室內(nèi)的濕度可適當(dāng)高些，在生長周期內(nèi)不超過50%。在擬南芥結(jié)莢時一般空氣濕度應(yīng)保持在30%左右。浸染期間，溫度保持在20～25°C，避免溫度太高。暗處理時間也不宜過長，一般22～24h即可，以免植株長時間避光而黃化，影響植株長勢，從而降低浸染效率。

超量表達(dá)載體pCAMIBA3301所用啟動子為35S啟動子，可使目的基因超強表達(dá)，一般情況下，陽性轉(zhuǎn)基因植株中的目的基因表達(dá)量會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組植株，但由于轉(zhuǎn)化、生長及外源基因整合位置的不確定性等多種因素，不同轉(zhuǎn)基因植株目的基因的表達(dá)量會存在一定程度上的差異。因此，在研究過程中，為避免各株系之間的差異對功能研究的影響，選取目的基因表達(dá)量相近，且表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行研究。基于植株自身的排外機制及遺傳分離規(guī)律，將To及T1代定為不穩(wěn)定世代，以T2或T3代作為純合世代進(jìn)行生理生化及分子功能研究，結(jié)果可信度更高，且表型或生理生化特征更加穩(wěn)定。值得說明的是，單獨使用抗生素（Kan）對轉(zhuǎn)基因To代植株進(jìn)行篩選時，會出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，從而加大后期T1代株系篩選的工作量，延緩了實驗進(jìn)程。因此，適時對To代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子水平的鑒定，杜絕假陽性轉(zhuǎn)基因植株的出現(xiàn)是非常有必要的。