鄧麗莎　施宇萌　王榮雪　馮若晨　王沁梅　戚馨月　汪海峰　周建新

[摘要]通過濾紙片法、平板計數(shù)法和生長曲線法等方法研究了花生殼分級萃取物對大腸桿菌的抑制作用。結(jié)果表明，不同溶劑花生殼萃取物對大腸桿菌的抑制作用存在差異性，乙酸乙酯萃取物抑菌效果最強，而且濃度越大，抑菌效果越強。不同溶劑花生殼萃取物對大腸桿菌的MIC和MBC也存在差異，乙酸乙酯萃取物最低，分別為31.255mg/mL和62.5mg/mL。其抗菌能力與萃取物中總多酚含量呈正相關(guān)，初步判定起主要抗菌作用的物質(zhì)是多酚類。本研究為花生殼開發(fā)成高附加值天然糧食防霉劑或食品防腐劑提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]花生殼;分級萃取物;大腸桿菌;抑菌作用

中圖分類號：TS207.3 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.201909

花生是我國重要的油料和經(jīng)濟作物，年產(chǎn)量達到1 450萬t以上，加工成花生仁、油等過程中每年產(chǎn)生約450萬t的花生殼。黃酮類、多酚類物質(zhì)在花生殼中含量較高，具有抗菌、抗氧化、降血脂和膽固醇和治療冠心病的作用[1]。但與發(fā)達國家相比，我國花生殼資源的開發(fā)和利用程度還相距甚遠，僅作為燃料和肥料使用，用作農(nóng)副產(chǎn)品下腳料方面尚未得到有效開發(fā)。林姣[2]研究表明花生殼含有豐富的黃酮類化合物，其中木犀草素含量較多且具有抗菌作用。楊洋等[3-4]確定了花生殼木犀草素最佳提取工藝，測定了花生殼木犀草素抑菌特性，其抑菌活性強于同濃度的山梨酸和亞硝酸鈉。陳春濤等[5]以甲醇粗提、溶劑梯度萃取配合抑菌活性跟蹤檢測，得到了花生殼乙酸乙酯組分，并用酸堿沉淀、柱層析等法純化得到3種化合物，發(fā)現(xiàn)這3種化合物都有一定抑菌效果。邢俊紅[6]采用濾紙片抑菌圈法探討花生殼多酚類物質(zhì)對3種常見細菌的抑菌效果，結(jié)果表明花生殼多酚類物質(zhì)對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的生長有很好的抑制作用，且對大腸桿菌的抑制作用最強。也有國內(nèi)外學(xué)者研究或報道了黃酮類化合物的安全性，表明是無毒物質(zhì)[7]，這些研究表明花生殼提取物具有抗菌性，具有作為天然糧食防霉劑或食品防腐劑的開發(fā)潛力，而不同溶劑的花生殼分級萃取物的抗菌性研究未見報道。以食品中常見的腐敗菌和致病菌大腸桿菌為對象，研究了不同溶劑的花生殼分級萃取物對其的抑制作用，初步探索了抗菌機理，為其開發(fā)高附加值天然糧食防霉劑或食品防腐劑和高效開發(fā)花生殼資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

大腸桿菌：江蘇省疾病預(yù)防控制中心微生物試劑廠;牛肉膏、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;瓊脂：石獅市環(huán)球瓊膠工業(yè)有限公司;平板計數(shù)瓊脂：海博生物技術(shù)有限公司;石油醚、氯仿、乙酸乙酯（AR）：廣東光華科技股份有限公司;無水乙醇（AR）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司;蒸餾水：實驗室自制。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FW100型高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司;SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠;101-34S型電熱鼓風(fēng)干燥器：上海蘇進儀器設(shè)備廠;LDZX-50FBS型立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠;GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;U-3900型紫外可見光光度計：日立高新技術(shù)公司;HZ1001A型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司;BSC-1300ⅡA2 型生物安全柜：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠;ZQTY-70S型大容量低溫搖床：上海知楚儀器有限公司;TDL-5-A型臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠;鍍鉻游標(biāo)卡尺（0～150mm）：桂林量具廠。

1.3 花生殼分級萃取物的制備

選取產(chǎn)自江蘇省南通市的優(yōu)質(zhì)花生，手工剝殼并除去發(fā)黑、蟲洞品。將花生殼清洗瀝干后置于50℃烘箱中烘干4h，粉碎過40目篩。稱取400.00g花生殼粉，濾布包扎，置于索氏抽提器內(nèi)，先用石油醚萃取8h，收集石油醚溶液，過濾，旋蒸后冷凍干燥，得到石油醚萃取物，4℃保存?zhèn)溆?。用相同的方法，對過濾后的殘渣依次用氯仿、乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水萃取，分別得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、無水乙醇萃取物和蒸餾水萃取物，用50%乙醇溶液定容至400mL，此時不同溶劑花生殼萃取物的濃度均為1 000mg/mL（原料花生殼/定容體積），并對萃取物倍比稀釋成500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、32.15mg/mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 濾紙片法測定花生殼分級萃取物對大腸桿菌抑菌圈

取0.1mL大腸桿菌肉湯培養(yǎng)液（106-107CFU/mL）均勻涂布于平板計數(shù)瓊脂平板上，將直徑為6mm無菌濾紙片置于制備的萃取物溶液中浸泡3h，取出瀝干后3個1組呈正三角形平鋪皿中，以50%乙醇作為對照。倒置培養(yǎng)（36±1℃，24h）。用游標(biāo)卡尺十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.4.2 平板計數(shù)法測定花生殼分級萃取物對大腸桿菌抑制率

在平板計數(shù)培養(yǎng)基中按照5%的添加量分別加入制備的不同溶劑和梯度濃度萃取物，同樣以50%乙醇作為對照。滅菌，冷卻，加入1mL大腸桿菌肉湯培養(yǎng)液，混勻，傾注平板。倒置在恒溫箱培養(yǎng)（36±1℃，24h），計數(shù)，計算抑菌率。

（1）

1.4.3 花生殼乙酸乙酯和無水乙醇萃取物對大腸桿菌生長曲線的影響

試管中分別加入8mL肉湯培養(yǎng)基，0.5mL的500mg/mL、250mg/mL的花生殼乙酸乙酯和無水乙醇萃取物和1mL的大腸桿菌肉湯培養(yǎng)液，混勻，搖床培養(yǎng)（36±1℃，120 r/min），并在培養(yǎng)0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h時取出相應(yīng)的試管，振蕩器上振蕩10s，使菌體均勻懸浮于培養(yǎng)基中，立即用紫外分光光度計600nm處測吸光度[8-9]。

1.4.4 花生殼分級萃取物最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定

準(zhǔn)確量取10 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分裝試管。配制含不同濃度的花生殼分級萃取物溶液的液體培養(yǎng)基，花生殼萃取物濃度梯度設(shè)為500mg/mL、250mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625mg/mL、7.812 5mg/mL。每一系列梯度接種大腸桿菌培養(yǎng)液100ug。將液體培養(yǎng)基放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（36℃，200r/min，12h）。渾濁的試管為陽性對照管，即為有菌生長;陰性對照管為透明試管，代表無菌生長。呈透明液體的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。將認為不長菌的試管（透明液體）從低濃度到高濃度取3支，各吸取1mL液體于培養(yǎng)皿中，加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（36±1℃），無菌落生長的最低濃度為最低殺菌濃度（MBC）[10]。

1.4.5 花生殼分級萃取物總多酚含量的測定（Folin-Ciocalteu法）

配制500μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0 mL于10mL比色管中定容。從各溶液中吸取1 mL加入25 mL容量瓶內(nèi)，加10 mL蒸餾水，1.5mL Folin-Ciocalteu試劑，在0.5～8min內(nèi)加入6mL 10% Na2CO3溶液，加水定容，然后在30℃下避光放置反應(yīng)2h，以0樣為空白，在760nm處測定吸光度。吸光度（y）對濃度（x）的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：y=3.500 3x+0.011 9，R2=0.999。準(zhǔn)確移取1 000 mg/mL的各萃取物1mL于25mL容量瓶中，根據(jù)以上方法測定波長760nm處的吸光度，代入回歸方程計算萃取液中總多酚濃度（萃取液中總多酚濃度按沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品計）。

2 結(jié)果與討論

2.1 濾紙片法測定花生殼分級萃取物對大腸桿菌抑菌圈

濾紙片法測定不同濃度花生殼分級萃取物對大腸桿菌的抑制效果見圖1，抑菌圈直徑越大，表明抑菌效果越好。從圖中可以看出，同一濃度時，大多數(shù)乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌的抑制效果最顯著，花生殼乙酸乙酯萃取物濃度越大，對大腸桿菌的抑制效果越好，而其他萃取物對大腸桿菌的抑制效果與濃度關(guān)系不大。

2.2 平板計數(shù)法測定花生殼分級萃取物對大腸桿菌抑制率

平板計數(shù)法測定不同濃度花生殼分級萃取物對大腸桿菌抑制率見圖2，由圖可知，在相同濃度時，抑菌效果為乙酸乙酯萃取物>乙醇萃取物>石油醚萃取物>氯仿萃取物>水萃取物;對于同種萃取物，隨著濃度的增加，對大腸桿菌的抑菌效果增強。

2.3 花生殼乙酸乙酯和無水乙醇萃取物對大腸桿菌生長曲線的影響

花生殼乙酸乙酯、無水乙醇萃取物對大腸桿菌生長曲線的影響見圖3，由圖3可知，對于不加萃取物的對照組，大腸桿菌很快進入對數(shù)生長期，而實驗組的大腸桿菌生長曲線的延滯期不同程度的延長，在生長期、穩(wěn)定期時，數(shù)量也不同程度比對照組低。500mg/mL乙酸乙酯萃取物甚至無明顯的對數(shù)生長期，菌量很低。

2.4 花生殼分級萃取物最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）的測定

MIC即最低抑菌濃度，指的是抑制細菌生長所需的最低藥物濃度;MBC即最低殺菌濃度，指的是能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)細菌（即殺死99.9%供試微生物）的最低濃度。花生殼分級萃取物對大腸桿菌的MIC及MBC分別見表1、表2，從表中可以看出，花生殼的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、無水乙醇、水萃取物對大腸桿菌的MIC分別為62.5、250、31.25、62.5和125mg/mL;而MBC則分別為125mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、62.5mg/mL和125mg/mL。因此，花生殼乙酸乙酯對大腸桿菌MIC及MBC都是最低的，能夠在較低濃度下達到抑菌效果。

2.5 花生殼分級萃取物總多酚含量的測定

花生殼溶劑分級萃取物（1 000mg/mL）中總多酚含量的測定結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，花生殼萃取物中總多酚含量最高的是花生殼乙酸乙酯萃取物，其次為無水乙醇、水、氯仿和石油醚萃取物，與上述抗菌結(jié)果比較，花生殼萃取物中的總多酚含量與對大腸桿菌抑菌效果呈正相關(guān)。

3 結(jié) 論

通過濾紙片法、平板計數(shù)法和生長曲線法測定了不同溶劑花生殼萃取物對大腸桿的抗菌活性，表明不同溶劑存在差異性，乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌的抑制效果最強。并且花生殼乙酸乙酯萃取物濃度越大，對大腸桿菌的抑制效果越強。

不同溶劑花生殼萃取物對大腸桿菌的MIC和MBC也存在差異，乙酸乙酯萃取物最低，分別為31.25 mg/mL和62.5mg/mL。

不同花生殼分級萃取物中的總多酚含量不一樣，含量與其抗菌能力呈正相關(guān)，初步判定花生殼分級提取物中起主要抗菌作用的物質(zhì)是多酚類。

參考文獻

[1] 楊國峰，周建新，汪海峰，等.花生殼提取物的制備及其抗氧化與抗菌活性的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)， 2007，33（2）： 97-101.

[2] 林姣.花生殼木犀草素的提取分離及抗菌作用的研究[D].南京： 南京財經(jīng)大學(xué)，2013.

[3] 楊洋，聶靜然，關(guān)紅艷，等.花生殼木犀草素的提取及其抑菌性能研究[J].食品科技，2009，34（12）：211-216.

[4] 聶靜然.花生殼中木犀草素的分離提純及其抑菌性能研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2018.

[5] 陳春濤，馬慶一，高玉美，等.花生殼中木犀草素等抑菌活性成分的提取、純化與研究[J].食品科學(xué)，2003，24（5）：84-88.

[6] 邢俊紅.花生殼多酚的提取工藝及活性研究[D].大連：大連工業(yè)大學(xué)，2015.

[7] ZGORKA G A，HAJNOS A A.The application of solid-phase extraction and reversed phase high-performance liquid chromatography for simultaneous isolation and determination of plant flavonoids and phenolic acids[J].Journal of Chromatography A，2006，1137（2）：145-152.

[8] 龍海榮.黃酮類化合物的安全性研究進展[J].食品研究與開發(fā)， 2008（10）：154-157.

[9] 馮亞凈，張媛媛，王瑞鑫，等.五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機理及效果[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2016，42（2）：72-76.

[10] 周琰冰，趙鑫薈，艾啟俊.三種中草藥對大腸桿菌的抑制作用及機理初探[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2013，30（12）：294-300.

[11] 趙二勞，武宇芳，白建華.花生殼不同溶劑提取物的總酚含量及抗氧化性的比較研究[J].食品科學(xué)，2012，33（11）：79-81.