李 潔，鄒余糧，裴美麗，江 玉

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061)

卵巢癌是死亡率較高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其主要病理類型為上皮性卵巢癌。卵巢癌發(fā)病隱匿，且易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，就診時(shí)多已發(fā)展至晚期[1]。盡管治療手段在不斷發(fā)展，但卵巢癌患者的5年生存率仍無明顯改善[2]。獲得新的早期輔助診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)并研發(fā)靶向藥物，是目前卵巢癌研究的主要方向[2]。

瓦伯格效應(yīng)，即有氧糖酵解，是維持腫瘤細(xì)胞惡性表型的重要能量代謝特征，它不僅可以為腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)提供大分子合成代謝的前體物質(zhì)，滿足腫瘤細(xì)胞存活的能量需求，還能創(chuàng)造適宜的微環(huán)境，為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)[3-4]。己糖激酶(hexokinase, HK)可將葡萄糖催化生成6-磷酸葡萄糖，它是糖酵解途徑的第1個(gè)酶，也是糖酵解途徑的限速酶[5]。在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)，一共有4種亞型的己糖激酶，它們各自有一定的組織特異性。Ⅰ型在腦組織中表達(dá)特別高；Ⅱ型是胰島素敏感型的，主要存在于脂肪及肌組織中；Ⅲ型在肝、腎和腸組織中有微量的表達(dá)；Ⅳ型僅在肝和胰中存在，即葡萄糖激酶[6]。在生長(zhǎng)迅速的腫瘤細(xì)胞中，以HK2高表達(dá)為主[7]。本研究探討HR2在卵巢癌組織中的表達(dá)及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標(biāo)本 收集2017年1月至12月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科住院手術(shù)切除的27例卵巢癌患者新鮮手術(shù)標(biāo)本，年齡32～68歲(中位數(shù)為53歲)。所有患者均行卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為卵巢上皮性癌，術(shù)前均未予以放射和化學(xué)治療。另收集正常卵巢組織14例(因子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮+雙附件手術(shù))，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為正常卵巢組織。

1.1.2細(xì)胞 人卵巢癌細(xì)胞SKOV3由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

1.1.3主要試劑及儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國(guó)GIBCO公司，HK2過表達(dá)質(zhì)粒購自美國(guó)ADDgene公司，HK2 siRNA購自廣州銳博公司，X-treme GENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自瑞士羅氏公司，CCK8檢測(cè)試劑盒由日本同仁化學(xué)研究所提供，HK2及β-actin抗體購自美國(guó)Cell signaling公司，HRP標(biāo)記的免疫組化二抗試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1組織RNA提取 組織中加入液氮研磨成粉后加入1 mL Trizol試劑，室溫靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，充分劇烈振蕩后于室溫靜置2～3 min，室溫離心15 min；離心后樣品分層，取上清加入0.5 mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min后，室溫離心10 min后棄去上清；向沉淀中加入1 mL乙醇，輕輕混勻。室溫離心5 min后棄上清；將RNA樣品晾干(不要徹底干燥)，加入適量DEPC水溶解。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HK2 mRNA的表達(dá) 使用美國(guó)Thermo公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄。將引物干粉稀釋成10 μmol/L的工作濃度，以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，按下述體系配制實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)液：SYBY Green 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 7.2 μL；反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)共40個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)未加模板的陰性對(duì)照組，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算RQ值，比較每組之間的基因表達(dá)差異。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞使用含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、50 mL/L CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將SKOV3細(xì)胞懸液接種于6孔板中，待細(xì)胞數(shù)目達(dá)1×106/孔。配制轉(zhuǎn)染試劑混合液(每孔)：轉(zhuǎn)染試劑6 μL+質(zhì)粒2 μg(siRNA 15μL)+無血清無雙抗RPMI 1640 200 μL。冰上靜置20 min。逐孔棄去細(xì)胞原培養(yǎng)液，加入100 mL/L血清的RPMI 1640培養(yǎng)基1.3 mL及轉(zhuǎn)染試劑混合液200 μL。輕晃混勻后置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h提取總蛋白備用。

1.2.5CCK8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 用含100 mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，接種至96孔板，每孔1 000個(gè)細(xì)胞，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)21、45、69、93、117 h后，向每孔加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，測(cè)定各孔吸光度值(A450)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6Western blot檢測(cè)HK2蛋白表達(dá) 抽提細(xì)胞總蛋白，各取30 μg蛋白，SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，50 mL/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入HK2單克隆抗體(1∶500)或β-actin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜8 min×5次，加入相應(yīng)的二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜8 min×5次。加入發(fā)光試劑ECL曝光。

1.2.7免疫組化染色觀察組織病理改變 將石蠟切片置于二甲苯中脫蠟處理10 min×2次。將切片依次浸泡于下列試劑中：無水乙醇10 min，950 mL/L乙醇5 min，750 mL/L乙醇5 min。將切片置于去離子水中水化處理2 min×3次。采用PBS(pH 7.4)沖洗切片3 min×3次。高壓抗原修復(fù)：高壓鍋內(nèi)倒入2 L檸檬酸(0.01 mol/L)，加熱至沸騰后將切片放入，繼續(xù)加熱至高壓鍋噴氣時(shí)計(jì)時(shí)高壓15 min后自然冷卻。滴加過氧化氫到每張切片，室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗切片3 min×3次。滴加一抗孵育后PBS沖洗切片3 min×3次。滴加羊抗兔/鼠IgG抗體-HRP二抗，室溫孵育30 min。PBS沖洗切片3 min×3次。滴加新鮮配置的DAB顯色液，顯微鏡下觀察3～5 min，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有棕黃色顆粒出現(xiàn)時(shí)，立即采用去離子水終止反應(yīng)。PBS沖洗切片3 min×3次。蘇木素復(fù)染45 s，PBS沖洗切片3 min×3次。梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明處理后中性樹膠封片。顯微鏡下讀片，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0(Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組之間的差異比較采用獨(dú)立樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)，組間構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌組織及正常卵巢組織中HK2的表達(dá)水平實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)27例卵巢癌組織及14例正常卵巢組織中HK2的表達(dá)水平(圖1A)，結(jié)果提示，卵巢癌組織中HK2的mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織中HK2表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果提示，卵巢癌組織中的HK2表達(dá)水平高于正常卵巢組織(圖1B)。

圖1 HK2在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織

Fig.1 HK2 level in ovarian cancer tissues was higher than in normal ovarian tissues

A：實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果(N：正常卵巢組織；C：卵巢癌組織)；B：免疫組化結(jié)果(×200)。

2.2 HK2的表達(dá)與臨床分期及病理分級(jí)關(guān)系實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果提示，卵巢癌組織中的HK2表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期、病理分級(jí)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，臨床分期越晚(圖2A)，病理級(jí)別越高(圖2B)，伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(圖2C)的卵巢癌組織中HK2的表達(dá)水平更高。

相應(yīng)的，免疫組化結(jié)果和實(shí)時(shí)定量結(jié)果一致，HK2在卵巢癌組織中的表達(dá)水平和臨床期別，病理級(jí)別及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(表1)。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)卵巢癌組織中HK2表達(dá)與臨床分期(A)、病理分級(jí)(B)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(C)的關(guān)系

Fig.2 Correlation of HK2 expression with clinicopathological (A), pathological grade (B) and distant metastasis (C) of ovarian cancer tissues by qRT-PCR

2.3 HK2促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖能力在SKOV3細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染HK2過表達(dá)質(zhì)粒后，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HK2蛋白水平明顯上升(圖3A)，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)過表達(dá)HK2后SKOV3的增殖能力上升(圖3B)。在SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HK2 siRNA敲低HK2后，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HK2蛋白水平明顯下降(圖4A)，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，敲低HK2后SKOV3的增殖能力下降(圖4B)。

3 討 論

盡管當(dāng)今手術(shù)、化療、放療等治療手段已經(jīng)相對(duì)成熟[8-9]，卵巢癌的治療水平逐步提高，但是卵巢癌的預(yù)后仍無明顯改善[10-11]。近年來，靶向治療已經(jīng)明顯改善了癌癥患者預(yù)后[12]，但是，在卵巢癌的治療上，靶向藥物的應(yīng)用還面臨著很大的挑戰(zhàn)[13]。因此，深入了解卵巢癌的發(fā)生機(jī)制、明確其進(jìn)程中的關(guān)鍵分子可能為卵巢癌的精準(zhǔn)治療提供新的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)表明HK2在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，卵巢癌組織中HK2的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織，敲低HK2可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖能力，提示HK2可能作為治療卵巢癌的靶分子。本研究為卵巢癌的靶向治療提供新的“候選”分子。

表1 卵巢癌組織中HK2的表達(dá)與臨床分期及病理分級(jí)的關(guān)系

Tab.1 Correlation of HK2 expression with clinicopathological and pathological grade of ovarian cancer tissues by IHC

病理學(xué)特征n陽性率[n(%)]χ2P病理分級(jí) G164(66.7) G298(88.9) G31212(100.0)6.3620.029?臨床分期 Ⅰ～Ⅱ95(55.6) Ⅲ～Ⅳ1817(94.4)6.0140.030?遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 無148(57.1) 有1313(100.0)7.1630.016?

圖3 過表達(dá)HK2促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖能力

Fig.3 The growth of SKOV3 cells was significantly promoted by overexpression of HK2

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖能力。

圖4 敲低HK2抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖能力

Fig.4 The growth of SKOV3 cells was significantly inhibited by downexpression of HK2

A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖能力。

腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下，也傾向于通過糖酵解而不是產(chǎn)能效率更高的氧化磷酸化途徑代謝葡萄糖，為細(xì)胞生長(zhǎng)供能，這種現(xiàn)象稱為有氧糖酵解，即瓦伯格效應(yīng)[4,14]。瓦伯格效應(yīng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，靶向瓦伯格效應(yīng)中關(guān)鍵分子可能是癌癥治療的有效策略[13,15-17]。己糖激酶(HKs)是催化糖酵解的第一限速酶，它使用ATP作為磷酸鹽，供體催化葡萄糖磷酸化產(chǎn)生6-磷酸葡萄糖[4]。HK2是有氧糖酵解中的限速酶，它與線粒體的結(jié)合是瓦伯格效應(yīng)所必需的。HK2作為瓦伯格效應(yīng)的關(guān)鍵酶，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[18]。有研究者通過基因分析發(fā)現(xiàn)，在人肺癌細(xì)胞系NCI-H661和NCI-H460中，分別有61%和40%的HK2激活，而在人正常支氣管上皮細(xì)胞中只有0.9%激活[19]。本研究表明，HK2在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于正常卵巢組織中的表達(dá)，這與之前的研究報(bào)道一致。

本研究表明，HK2在卵巢癌中表達(dá)明顯增高，細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)提示，抑制HK2的表達(dá)可以有效抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，提示HK2可以作為治療卵巢癌的靶分子。系統(tǒng)靶向HK2可阻斷腫瘤生長(zhǎng)且不伴隨嚴(yán)重的不良反應(yīng)[20]。目前有多種用于抑制HK2功能的藥物，例如，葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose, 2-DG)通過負(fù)反饋機(jī)制抑制HK2活性，阻斷糖酵解途徑，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性[21]。Lonidamne作為靶向HK2的治療藥物，目前已經(jīng)完成了乳腺癌和肺癌的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并且與化療聯(lián)合時(shí)觀察到了更高的腫瘤反應(yīng)和更好的預(yù)后特性[22]。但是，在卵巢癌的治療中，靶向于瓦伯格關(guān)鍵分子的藥物研究尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果證實(shí)，HK2在卵巢癌組織中的表達(dá)水平高于正常卵巢組織，臨床分期越晚，病理分級(jí)越高，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者HK2的表達(dá)水平越高。這與之前的報(bào)道是一致的[23]。此外，我們?cè)诩?xì)胞水平上進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)，HK2可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖能力。本研究為靶向HK2治療卵巢癌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，HK2在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織，其具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖的作用，但是具體的作用機(jī)制仍需后續(xù)研究進(jìn)一步闡明。