謝兵兵，劉麗娟，盧寶全，韓富紅，蔡梅芝，王丹丹，劉志輝，張艷紅

(唐山市工人醫(yī)院，河北唐山 063000)

赤芍為芍藥科植物，主要活性成分為赤芍總苷，赤芍總苷具有多種生物活性，尤其對神經系統(tǒng)具有一定的藥理作用，可以鎮(zhèn)痛、改善神經突觸可塑性損傷等。大量研究顯示赤芍總苷對腦缺血損傷有明顯的保護作用，且赤芍總苷的神經保護作用也已在神經病理學的動物模型中得到證實[1-2]，但有關其作用機制的研究較少。Notch信號通路在進化過程中是高度保守的信號轉導通路，參與神經前體細胞自我更新能力的維持、增殖、分化與凋亡過程，局灶性腦梗死大鼠腦組織的Notch信號通路處于活化狀態(tài)，該通路的活化程度與腦梗死的預后緊密相關[3-4]。文獻報道赤芍總苷能夠通過下調Notch信號通路從而抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲[5]，而赤芍總苷對局灶性腦梗死大鼠腦組織Notch信號通路是否存在干預作用進而治療大鼠的局灶性腦梗死，目前尚鮮有報道，本課題就此進行了研究，現(xiàn)將結果匯報如下。

1 對象與方法

1.1 受試動物SPF級SD大鼠，體質量(180±20)g，雄性，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[動物許可證號：SCXK(京)2016-0011]。大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后進行試驗。

1.2 主要試劑與儀器小鼠抗大鼠NICD、兔抗Hes1、兔抗Hes5和β-actin均購自美國Chemicon公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司；Trizol總RNA提取試劑(武漢天源生物技術有限公司)；SpectraMax i3x 多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；冰凍切片機(德國Leica公司)；BX53型光學顯微鏡(日本Olympus公司)；手術器械；動物手術臺；天平。

1.3 方法

1.3.1腦卒中大鼠模型的制備 戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射全麻大鼠，大鼠全麻后置于操作臺，分離右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈。結扎頸外動脈及右側頸總動脈近心端。在右側頸總動脈近分叉處插入備用魚線，將栓線送至大腦中動脈分叉處，頸外動脈與頸內動脈分叉處為起點，進線約18.5 mm，栓線尾端留于皮膚外，栓塞1.5 h后抽線實現(xiàn)再灌注。以動物清醒后爬行時右轉圈，提尾時右前肢內收屈曲為入選標準。假手術組操作同上，僅暴露各組血管，不進行線栓插入。術后5 h采用Berderson評分評價存活大鼠的行為表現(xiàn)，評分2～4分提示造模成功。

1.3.2分組和給藥 將“1.3.1”項下造模成功的腦卒中大鼠分為5組，分別為模型組、赤芍總苷低劑量組、赤芍總苷中劑量組、赤芍總苷高劑量組和尼莫地平組，選擇假手術組大鼠為對照組，每組20只。對照組和模型組給予蒸餾水，赤芍總苷各劑量組分別給予灌胃赤芍總苷(由我院制劑科提供)5、10和20 mg/kg，尼莫地平組灌胃尼莫地平2 g/kg(亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準字：H14022821，規(guī)格20 mg/片)，連續(xù)給藥20 d。

1.3.3體質量測定 記錄各組大鼠給藥后的體質量變化，進行組間比較。

1.3.4各組大鼠腦含水量及腦梗死大小的測定 給藥結束后，將大鼠安樂處死，小心取腦，每組取10只大鼠的大腦，沿冠狀位切成2 mm的切片，置于20 g/L 2，3，5-氯化三苯基四氮唑浸泡30 min，使用NIH Image J軟件測定大腦梗死面積占皮層面積的百分比，按以下公式計算腦含水量，腦含水量=(濕重-干重)/濕重。

1.3.5Western blot檢測NICD、Hes1和Hes5的蛋白表達 給藥結束，每組5只大鼠，取大鼠半暗帶腦組織，稱重置于勻漿器，以1 mL∶100 mg加入預冷的組織細胞裂解液(Lysis Buffer)、5 μL磷酸酶抑制劑、5 μL蛋白酶抑制劑和5 μL PMFS，研磨均勻，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，留上清，采用BCA法蛋白定量。加SDS loading buffer煮沸，置于-70 ℃冰箱備用。SDS-PAGE電泳每孔加樣40 μg，轉膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h。Notch1 NICD一抗(1∶800)、Hes1(1∶500)、Hes5(1∶800)與內參β-actin(1∶200)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶4 000)室溫孵育60 min，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行ECL化學發(fā)光行條帶灰度分析。NICD、Hes1和Hes5抗體均購自Santa Cruz公司。

1.3.6RT-PCR檢測Hes1和Hes5 mRNA表達 給藥結束，每組5只大鼠，取大腦半暗區(qū)組織，冰上勻漿。于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清加等體積的異丙醇，加入乙醇離心，棄乙醇，干燥沉淀，加Rnase-free溶解，采用分光光度計檢測RNA純度。RT-PCR采用SYSB Premix Ex TaqTM進行。電腦自動分析熒光信號，轉換為目的基因拷貝數(shù)與CT值，GAPDH為內參，引物序列可見表1。

表1 各基因引物序列

Tab.1 Gene sequences of primer

基因引物序列Hes1上游:5′-AAAGACGGCCTCTGAGCAC-3′下游:5′-GGTGCTTCACAGTCATTTCCA-3′Hes5上游:5′-GAAGGCCGACATCCTGGAGA-3′下游:5′-ACCAGGAGTAGCCCTCGCTGT-3′GAPDH上游:5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′下游:5′-GCGCCCAATACGACCAAATCC-3′

1.4 統(tǒng)計學處理應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，符合正態(tài)分布的資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠的體質量、腦含水量及梗死面積的比較

體質量、腦含水量及梗死面積數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。各組大鼠給藥前的體質量比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后，與對照組相比，模型組體質量降低(P<0.05)；與模型組比，赤芍總苷各組及尼莫地平組體質量有不同程度增高(表2)，赤芍總苷各組體質量呈劑量依賴性趨勢。

表2 各組大鼠的體質量、腦含水量及梗死面積的比較

Tab.2 Comparison of rat weight, brain water content and infarct size in each group

組別體質量(g, n=20)治療前治療后腦梗死百分比(%, n=10)腦含水量(%, n=10)對照組186.50±12.59244.32±13.510.00±0.0012.81±1.61模型組189.51±15.22192.51±13.90?29.42±4.21?35.60±5.62?赤芍總苷低劑量187.54±13.42200.61±13.4221.61±3.80#30.42±4.21#赤芍總苷中劑量182.40±16.21216.82±13.83#19.52±3.81#24.60±3.82#△赤芍總苷高劑量186.53±14.52225.81±12.92#△17.30±3.41#△23.62±3.12#△尼莫地平184.91±13.50229.61±13.10#△16.82±3.00#△22.10±2.43#△F0.56640.78283.93144.354P0.726<0.001<0.001<0.001

與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與赤芍總苷低劑量組相比，△P<0.05。

2.2 各組大鼠腦組織NICD、Hes1和Hes5蛋白的表達經正態(tài)性檢驗，NICD、Hes1和Hes5蛋白表達符合正態(tài)分布。與對照組比，模型組NICD、Hes1和Hes5蛋白表達明顯增高(P<0.05)；與模型組比，赤芍總苷各組及尼莫地平組NICD、Hes1和Hes5均有不同程度降低(圖1)，赤芍總苷各組NICD、Hes1和Hes5變化呈劑量依賴性趨勢。

圖1 各組大鼠腦組織NICD、Hes1和Hes5蛋白的表達與比較

Fig.1 Expressions of NICD, Hes1 and Hes5 in rat brain tissue of each group

與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與赤芍總苷低劑量組相比，△P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織的Hes1和Hes5 mRNA表達情況經正態(tài)性檢驗，Hes1和Hes5 mRNA表達符合正態(tài)分布。與對照組比，模型組Hes1和Hes5 mRNA明顯增高(P<0.05)；與模型組比，赤芍總苷各組及尼莫地平組Hes1和Hes5 mRNA均有不同程度降低(圖2)，赤芍總苷各組Hes1和Hes5 mRNA變化呈劑量依賴性趨勢。

圖2 各組大鼠腦組織的Hes1和Hes5 mRNA的表達與比較

Fig.2 Expressions of Hes1 and Hes5 mRNA in rat brain tissue of each group

模型組與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與赤芍總苷低劑量組相比，△P<0.05。

3 討 論

赤芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia Lacti Flora Pall)或川赤芍(Paeonia Veitchii Lynch)的干燥根，是中醫(yī)常用于治療心腦血管疾病的藥物。赤芍總苷是赤芍的有效成分。研究顯示，赤芍總苷具有較強的神經細胞保護效應，進而抑制腦缺血腦水腫的發(fā)生[6]，但該效應的機制研究較少。

大量研究顯示，Notch信號通路與腦缺血再灌注損傷過程緊密相關，成熟大腦缺血后，腦室下區(qū)(SVZ)的增殖細胞Notch信號高表達，Notch 信號通路活性增強可明顯增加缺血新生血管數(shù)量及血液灌注量，促進缺血性損傷[7]，同時也可調節(jié)缺血誘導的神經損傷，γ-分泌酶被激活，釋放下游分子NICD、Hes1和Hes5。NICD、Hes1和Hes5表達增高提示缺血后膠質細胞和神經元之間存在細胞間通訊，誘導神經元死亡，通過調節(jié)NF-κB、凋亡前體蛋白并加重神經元凋亡。即使短暫性腦缺血，急性期海馬CA1區(qū)的Notch信號通路被活化，NICD水平增高，神經祖細胞數(shù)目增加，Notch信號通路被抑制，神經祖細胞的分化明顯增加[8-9]。局灶性腦缺血后，通過-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號的活性可以起到神經保護作用和抗炎作用[10-11]。本課題結果顯示，不同劑量的赤芍總苷可呈劑量依賴性地降低腦組織的NICD、Hes1和Hes5蛋白水平，同期也可以降低腦組織的Hes1和Hes5 mRNA水平。其機制有直接或間接兩種[12-13]：①含有赤芍的化濕行瘀清熱方可通過阻斷Notch信號通路相關蛋白表達，機制尚不明確；②含有赤芍總苷的芍藥湯可抑制Notch1和Hes1 mRNA及蛋白表達調控Notch信號通路達到治療葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的結腸炎小鼠；③赤芍總苷通過抑制NF-κB p65DNA結合活性及其下游VEGF基因的表達，抑制VEGF與其受體的作用，而Notch的失活狀態(tài)是受VEGF負反饋調節(jié)，達到降減及改善輕梗死炎癥反應的效果。

本課題存在的不足：Notch信號轉導通路對腦缺血性腦損傷是有害還是保護仍存在爭議。本課題結果顯示，赤芍總苷可通過抑制局灶性腦梗死大鼠腦組織Notch信號通路而達到保護效果，但研究顯示抑制Notch1信號可降低腦室管膜下區(qū)增生的細胞，阻滯腦缺血誘導的細胞增殖，可見Notch1信號可能在腦缺血神經再生中起重要作用，因此，仍有必要從腦細胞神經再生角度考察赤芍總苷對局灶性腦梗死的干預效果，為赤芍總苷的臨床應用提供參考。

綜上所述，赤芍總苷可用于治療局灶性腦梗死，其機制可能與抑制腦組織Notch信號通路相關。