黃 霖,廖盼麗,張 炯
(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院,武漢市婦幼保健院兒科腎內(nèi),湖北武漢 430016)
缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是發(fā)生急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)的重要原因之一。腎臟IRI也是腎臟病研究的熱點(diǎn)之一,但目前缺乏有效的預(yù)防和干預(yù)手段。腎小管上皮細(xì)胞的損傷和死亡是腎臟IRI中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。在腎臟IRI過(guò)程中,缺氧所致的鈣超載、線粒體能量合成障礙、氧自由基生成增加等因素均可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的凋亡脫落[1-2]。這將促發(fā)天然免疫反應(yīng),募集并活化巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,且啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng),促使T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤(rùn)腎臟組織,級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)腎臟組織中的炎癥瀑布效應(yīng),進(jìn)而促使腎臟功能發(fā)生障礙[3-4]。
萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)是一種存在于十字花科植物中的天然異硫氰酸鹽,具有較好的抗氧化應(yīng)激活性和抗炎癥活性。萊菔硫烷被報(bào)道具有抗癌和保護(hù)心臟的作用[5-6],但其對(duì)腎IRI的作用與影響尚不清楚。因此,本研究擬基于小鼠腎IRI模型來(lái)探析萊菔硫烷對(duì)腎IRI的作用與機(jī)制。
1.1 試劑與儀器萊菔硫烷(SFN,HY-13755,圖1)購(gòu)于美國(guó)MCE公司,溶解于PBS(pH 7.4)。Nrf-2抗體(ab156883)、Keap-1抗體(ab119403)、p-iκBα抗體(ab133462)、iκBα抗體(ab32518)、p-p65抗體(ab86299)、GAPDH抗體(ab9485)和PCNA抗體(ab18197)均購(gòu)自Abcam公司。TUNEL試劑盒(1684809,Roche)購(gòu)于美國(guó)Roche公司。小鼠TNF-α ELISA試劑盒(CSB-E04741m)、小鼠IL-1β ELISA試劑盒(CSB-ET011614MO)和小鼠IL-6 ELISA試劑盒(CSB-E04639m)購(gòu)自武漢華美公司。倒置熒光顯微鏡(TS100,Nikon公司,日本),石蠟包埋機(jī)(Leica公司,德國(guó)),石蠟切片機(jī)(Leica公司,德國(guó))。
圖1 萊菔硫烷的結(jié)構(gòu)式
Fig.1 The formula for sulforaphane
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組24只健康雄性C57小鼠(北京華阜康),體質(zhì)量15~22 g(動(dòng)物合格證號(hào)410102013),飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院。隨機(jī)分為4組(n=6):假手術(shù)對(duì)照組(Ctrl)、腎缺血再灌注組(IRI)、萊菔硫烷干預(yù)腎缺血再灌注組(IRI+SFN)、萊菔硫烷單獨(dú)給藥組(SFN)。術(shù)前24 h對(duì)SFN處理組小鼠尾靜脈注射500 μg/kg SFN[7]。Ctrl組和IRI組則尾靜脈注射等體積的無(wú)菌PBS溶液。以無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉小鼠雙側(cè)腎蒂45 min建立腎IRI模型,Ctrl組除不夾閉雙側(cè)腎蒂外其他操作同上,具體手術(shù)術(shù)式參考既往報(bào)道[8]。
1.3 生化檢測(cè)在各組小鼠恢復(fù)腎臟血流灌注24 h以后,以40 mL/L水合氯醛麻醉處死小鼠。收集小鼠全血和腎組織標(biāo)本。小鼠全血在2~8 ℃下3 000 r/min離心10 min后收集上層血清,分裝存儲(chǔ)于-80 ℃?zhèn)溆?。取小鼠血清送醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血清中肌酐(creatinine)和尿素氮(urea nitrogen)的水平。
1.4 腎臟病理檢測(cè)留取的小鼠腎組織,取部分置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定,剩余部分均存于-80 ℃。將固定好的小鼠腎組織進(jìn)行石蠟包埋、切片,切片厚度為1.5 μm,再進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察腎組織的病理學(xué)變化。
1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡小鼠腎組織石蠟切片經(jīng)二甲苯浸洗2次脫蠟,每次5 min,梯度乙醇脫水。用蛋白酶K工作液在37 ℃下封閉20 min,PBS洗2次。制備TUNEL反應(yīng)混合液,處理組用50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻,反應(yīng)在室溫下處理10 min。加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上,在37 ℃下暗濕盒中反應(yīng)1 h。PBS漂洗3次后,DAPI復(fù)染10 min,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。激發(fā)光波長(zhǎng)為450 nm,檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。
1.6 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平分離出各組小鼠血清以后,按梯度制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將待測(cè)血清和標(biāo)準(zhǔn)品溶液按100 μL/孔加入預(yù)包被的酶標(biāo)板里面,4 ℃過(guò)夜。棄上清后,PBST洗3次,每次2 min。加入100 μL生物素標(biāo)記抗體,在37 ℃下孵育1 h。棄上清,PBST洗3次,每次2 min。加入100 μL TMB溶液,在37 ℃下避光孵育30 min。加入50 μL反應(yīng)終止液,用酶標(biāo)儀讀取在450 nm下的各樣本讀數(shù)。
1.7 Western blot法檢測(cè)小鼠腎組織中Nrf-2、Keap-1、p-iκBα、iκBα和p-p65的蛋白表達(dá)分別提取小鼠腎組織的總蛋白和細(xì)胞核蛋白,測(cè)定蛋白含量以后,分別取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。分離完畢后,轉(zhuǎn)膜并封閉,總蛋白分別加入Nrf-2抗體、Keap-1抗體、p-iκBα抗體和iκBα抗體,選擇GAPDH抗體作為內(nèi)參抗體。細(xì)胞核蛋白分別加入p-p65抗體,選擇PCNA抗體作為內(nèi)參抗體。一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜,TBST洗脫后,加入生物素化二抗在室溫下孵育2 h,ECL顯色并進(jìn)行成像分析。
2.1 萊菔硫烷可改善缺血再灌注小鼠腎功能生化檢測(cè)結(jié)果表明,與Ctrl組血肌酐[(50.41±6.19)μmol/L]和尿素氮[(38.40±11.55)μmol/L]水平相比,缺血再灌注組小鼠血肌酐水平升高[(108.01±27.96)μmol/L,P=0.007]、尿素氮水平升高[(106.00±12.35)μmol/L,P=0.002],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而萊菔硫烷干預(yù)缺血再灌注小鼠后血肌酐水平降低到(87.01±10.98)μmol/L(P=0.016),尿素氮水平降低到(76.60±14.23)μmol/L(P=0.008),這提示萊菔硫烷可改善缺血再灌注損傷引起的小鼠腎功能。正常小鼠單獨(dú)使用萊菔硫烷后,血肌酐和尿素氮水平并未升高(圖2)。
圖2 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠的腎功能檢測(cè)
Fig.2 Renal function test after intervention by sulforaphane
A:血肌酐;B:血尿素氮。與Ctrl組比較,#P<0.05。與IRI組比較,*P<0.05,**P<0.01。
2.2 萊菔硫烷可改善小鼠腎缺血再灌注損傷并減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡TUNEL染色及其對(duì)應(yīng)的凋亡指數(shù)也表明,與IRI組相比,IRI+SFN組和SFN組的小鼠腎臟發(fā)生凋亡的腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量減少(圖3A)?;赥UNEL染色的分析顯示IRI組的凋亡指數(shù)是(51.67±7.63)%,而IRI+SFN組小鼠腎組織的凋亡指數(shù)降到了(12.33±2.52)%(P=0.018),SFN組小鼠腎組織中凋亡指數(shù)下降到(2.33±1.52)%(P=0.023,圖3B)。HE染色結(jié)果顯示,IRI組小鼠腎小管發(fā)生明顯擴(kuò)張,間質(zhì)水腫,刷狀緣明顯脫落,腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生空泡變性和死亡。而萊菔硫烷干預(yù)后,缺血再灌注損傷引起的小鼠腎小管擴(kuò)張減輕,腎小管上皮細(xì)胞空泡變性減輕,凋亡減少,刷狀緣脫落明顯減少(圖3C)。
2.3 萊菔硫烷可降低缺血再灌注損傷小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,IRI組小鼠血清中TNF-α增至(506.20±148.93)pg/mL(P=0.003)、IL-1β增至(454.50±122.39)pg/mL(P=0.002),IL-6的分泌量增至(243.20±87.78)pg/mL(P=0.005),而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后,小鼠血清中TNF-α降至(212.41±132.56)pg/mL(P=0.001)、IL-1β降至(189.03±75.18)pg/mL(P=0.003),IL-6的分泌量降至(131.40±44.98)pg/mL(P=0.004)。且單獨(dú)使用萊菔硫烷組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平較Ctrl組未見(jiàn)明顯的增高(P>0.05,圖4)。
2.4 萊菔硫烷增加缺血再灌注損傷小鼠腎組織中Nrf-2的表達(dá)Western blot檢測(cè)小鼠腎組織總蛋白結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,IRI組小鼠腎組織中Nrf-2的表達(dá)量減少(P=0.002);而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后,小鼠腎組織中Nrf-2的表達(dá)量增加(P<0.001)。與Ctrl組比較,IRI組小鼠腎組織中Keap-1的表達(dá)量未見(jiàn)降低(P>0.05),而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后,小鼠腎組織中Keap-1的表達(dá)量也未見(jiàn)降低(P>0.05,圖5)。
2.5 萊菔硫烷減少缺血再灌注損傷小鼠腎組織中p-iκBα和胞核內(nèi)p-p65的表達(dá)Western blot檢測(cè)小鼠腎組織總蛋白的結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,IRI組小鼠腎組織中p-iκBα的表達(dá)量增多(P<0.001),而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷的小鼠后腎組織中p-iκBα的表達(dá)量降低(P=0.003)。Western blot檢測(cè)小鼠腎組織細(xì)胞核蛋白的結(jié)果顯示,與Ctrl組比較,IRI組小鼠腎組織中p-p65的表達(dá)量增多(P=0.004),而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷小鼠后腎組織中p-p65的表達(dá)量降低(P=0.001,圖6)。
腎缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制涉及氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。來(lái)源于十字花科植物的萊菔硫烷具有較好的抗氧化應(yīng)激作用[9],但其對(duì)腎缺血再灌注損傷的作用與機(jī)制尚不完全清楚。本研究觀察到IRI組小鼠血肌酐和尿素氮水平均升高,而萊菔硫烷干預(yù)缺血再灌注小鼠以后血清血肌酐和尿素氮水平降低。IRI組小鼠腎小管發(fā)生擴(kuò)張,腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生空泡變性和死亡,刷狀緣明顯脫落。而萊菔硫烷干預(yù)后,缺血再灌注損傷引起的小鼠腎小管擴(kuò)張減輕,腎小管上皮細(xì)胞空泡變性減輕,死亡減少,刷狀緣脫落明顯減少。IRI+SFN組的小鼠腎臟中發(fā)生凋亡的腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少,這些結(jié)果都提示出萊菔硫烷可改善缺血再灌注損傷引起的小鼠腎損傷。
圖3 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠的病理檢測(cè)
Fig.3 Pathologic detection of sulforaphane after intervention in mice
A:TUNEL染色;B:基于TUNEL染色的凋亡指數(shù);C:HE染色(×200)。與IRI組比較,*P<0.05。
圖4 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠血清中炎癥因子水平的變化
Fig.4 Changes of inflammatory factors in serum of mice after intervention with sulforaphane
與Ctrl組比較,#P<0.05。與IRI組比較,*P<0.05。
圖5 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠腎組織中Nrf-2和Keap-1的Western blot檢測(cè)
Fig.5 Western blot detection of Nrf-2 and Keap-1 in renal tissues of mice after intervention with sulforaphane
A:Western blot檢測(cè)結(jié)果;B:Nrf-2/GAPDH的吸光度分析;C:Keap-1/GAPDH的吸光度分析。與Ctrl組比較,#P<0.05。與IRI組比較,*P<0.05。
圖6 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠腎組織中總蛋白的Western blot檢測(cè)
Fig.6 Western blot of kidney tissue of mice after intervention with sulforaphane
A:Western blot檢測(cè)小鼠腎組織總蛋白中p-iκBα和iκBα表達(dá);B:p-iκBα/iκBα的吸光度分析;C:Western blot檢測(cè)小鼠腎組織核蛋白中p-p65和PCNA表達(dá);D:p-p65/PCNA的吸光度分析。與Ctrl組比較,#P<0.05。與IRI組比較,*P<0.05,**P<0.01。
萊菔硫烷具有抗氧化應(yīng)激的功能,抗氧化應(yīng)激的作用主要通過(guò)影響Nrf-2信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)[10]。Nrf-2已經(jīng)被證實(shí)在多種疾病中具有抗氧化應(yīng)激從而保護(hù)機(jī)體的作用[11-13]。萊菔硫烷直接作用于Keap-1上的巰基而破壞Nrf-2-Keap-1復(fù)合體,或者激活MAPK信號(hào)通路使Keap-1發(fā)生磷酸化,最終導(dǎo)致Nrf-2從復(fù)合體中被釋放出來(lái),Nrf-2即可被激活而具有活性,然后發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)位,結(jié)合到ARE元件,參與轉(zhuǎn)錄激活Ⅱ相酶基因。醌氧化還原酶(NQO1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)等Ⅱ相酶在機(jī)體內(nèi)均具有很好的解毒作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn),IRI組小鼠腎組織中Nrf-2的表達(dá)量減少,而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后,小鼠腎組織中Nrf-2的表達(dá)量增加。IRI組小鼠腎組織中Keap-1的表達(dá)量未見(jiàn)降低,萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后,小鼠腎組織中Keap-1的表達(dá)量也未見(jiàn)降低。由此提示萊菔硫烷改善小鼠腎缺血再灌注損傷可能是通過(guò)影響Nrf-2相關(guān)信號(hào)而非Keap-1來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
萊菔硫烷還具有潛在的抗炎作用。LIN等[16]報(bào)道萊菔硫烷可以通過(guò)Nrf-2途徑抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。HEISS等[17]報(bào)道NFκB是萊菔硫烷調(diào)控抗炎作用的分子靶點(diǎn)。SUN等[18]也在肌營(yíng)養(yǎng)不良的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷可通過(guò)Nrf-2抑制NFκB而減弱肌肉的炎癥。本研究觀察到IRI組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量增多,而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后,小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量降低。且單獨(dú)使用萊菔硫烷組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量較于Ctrl組小鼠未見(jiàn)明顯的增多。當(dāng)炎癥活躍時(shí)iκBα發(fā)生磷酸化,NFκB p65與iκBα發(fā)生解離,NFκB p65繼而發(fā)生磷酸化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)下游炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)IRI組小鼠腎組織中p-iκBα的表達(dá)量增多,而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后,小鼠腎組織中p-iκBα的表達(dá)量降低。IRI組小鼠腎組織中p-p65的表達(dá)量增多,而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后,小鼠腎組織中p-p65的表達(dá)量降低。該結(jié)果提示萊菔硫烷可以抑制iκBα發(fā)生磷酸化, 進(jìn)而抑制NFκB p65的磷酸化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核并阻止其啟動(dòng)下游炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá),最終達(dá)到抗缺血再灌注損傷所致炎癥的作用。我們將在萊菔硫烷對(duì) Nrf-2介導(dǎo)的NFκB通路調(diào)控方面進(jìn)行深入研究,為萊菔硫烷的臨床應(yīng)用前景打下基礎(chǔ)。