黃 霖，廖盼麗，張 炯

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院，武漢市婦幼保健院兒科腎內(nèi)，湖北武漢 430016)

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是發(fā)生急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)的重要原因之一。腎臟IRI也是腎臟病研究的熱點之一，但目前缺乏有效的預(yù)防和干預(yù)手段。腎小管上皮細胞的損傷和死亡是腎臟IRI中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。在腎臟IRI過程中，缺氧所致的鈣超載、線粒體能量合成障礙、氧自由基生成增加等因素均可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞的凋亡脫落[1-2]。這將促發(fā)天然免疫反應(yīng)，募集并活化巨噬細胞和中性粒細胞，且啟動獲得性免疫反應(yīng)，促使T淋巴細胞和NK細胞浸潤腎臟組織，級聯(lián)誘導(dǎo)腎臟組織中的炎癥瀑布效應(yīng)，進而促使腎臟功能發(fā)生障礙[3-4]。

萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)是一種存在于十字花科植物中的天然異硫氰酸鹽，具有較好的抗氧化應(yīng)激活性和抗炎癥活性。萊菔硫烷被報道具有抗癌和保護心臟的作用[5-6]，但其對腎IRI的作用與影響尚不清楚。因此，本研究擬基于小鼠腎IRI模型來探析萊菔硫烷對腎IRI的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器萊菔硫烷(SFN，HY-13755，圖1)購于美國MCE公司，溶解于PBS(pH 7.4)。Nrf-2抗體(ab156883)、Keap-1抗體(ab119403)、p-iκBα抗體(ab133462)、iκBα抗體(ab32518)、p-p65抗體(ab86299)、GAPDH抗體(ab9485)和PCNA抗體(ab18197)均購自Abcam公司。TUNEL試劑盒(1684809，Roche)購于美國Roche公司。小鼠TNF-α ELISA試劑盒(CSB-E04741m)、小鼠IL-1β ELISA試劑盒(CSB-ET011614MO)和小鼠IL-6 ELISA試劑盒(CSB-E04639m)購自武漢華美公司。倒置熒光顯微鏡(TS100，Nikon公司，日本)，石蠟包埋機(Leica公司，德國)，石蠟切片機(Leica公司，德國)。

圖1 萊菔硫烷的結(jié)構(gòu)式

Fig.1 The formula for sulforaphane

1.2 實驗動物及分組24只健康雄性C57小鼠(北京華阜康)，體質(zhì)量15～22 g(動物合格證號410102013)，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院。隨機分為4組(n=6)：假手術(shù)對照組(Ctrl)、腎缺血再灌注組(IRI)、萊菔硫烷干預(yù)腎缺血再灌注組(IRI+SFN)、萊菔硫烷單獨給藥組(SFN)。術(shù)前24 h對SFN處理組小鼠尾靜脈注射500 μg/kg SFN[7]。Ctrl組和IRI組則尾靜脈注射等體積的無菌PBS溶液。以無創(chuàng)血管夾夾閉小鼠雙側(cè)腎蒂45 min建立腎IRI模型，Ctrl組除不夾閉雙側(cè)腎蒂外其他操作同上，具體手術(shù)術(shù)式參考既往報道[8]。

1.3 生化檢測在各組小鼠恢復(fù)腎臟血流灌注24 h以后，以40 mL/L水合氯醛麻醉處死小鼠。收集小鼠全血和腎組織標(biāo)本。小鼠全血在2～8 ℃下3 000 r/min離心10 min后收集上層血清，分裝存儲于-80 ℃?zhèn)溆?。取小鼠血清送醫(yī)院檢驗科檢測血清中肌酐(creatinine)和尿素氮(urea nitrogen)的水平。

1.4 腎臟病理檢測留取的小鼠腎組織，取部分置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，剩余部分均存于-80 ℃。將固定好的小鼠腎組織進行石蠟包埋、切片，切片厚度為1.5 μm，再進行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腎組織的病理學(xué)變化。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡小鼠腎組織石蠟切片經(jīng)二甲苯浸洗2次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇脫水。用蛋白酶K工作液在37 ℃下封閉20 min，PBS洗2次。制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻，反應(yīng)在室溫下處理10 min。加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，在37 ℃下暗濕盒中反應(yīng)1 h。PBS漂洗3次后，DAPI復(fù)染10 min，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡發(fā)生情況。激發(fā)光波長為450 nm，檢測波長為520 nm。每個樣本隨機選擇5個高倍視野，進行細胞計數(shù)計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=TUNEL陽性細胞/總細胞數(shù)×100%。

1.6 ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平分離出各組小鼠血清以后，按梯度制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將待測血清和標(biāo)準(zhǔn)品溶液按100 μL/孔加入預(yù)包被的酶標(biāo)板里面，4 ℃過夜。棄上清后，PBST洗3次，每次2 min。加入100 μL生物素標(biāo)記抗體，在37 ℃下孵育1 h。棄上清，PBST洗3次，每次2 min。加入100 μL TMB溶液，在37 ℃下避光孵育30 min。加入50 μL反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀讀取在450 nm下的各樣本讀數(shù)。

1.7 Western blot法檢測小鼠腎組織中Nrf-2、Keap-1、p-iκBα、iκBα和p-p65的蛋白表達分別提取小鼠腎組織的總蛋白和細胞核蛋白，測定蛋白含量以后，分別取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離。分離完畢后，轉(zhuǎn)膜并封閉，總蛋白分別加入Nrf-2抗體、Keap-1抗體、p-iκBα抗體和iκBα抗體，選擇GAPDH抗體作為內(nèi)參抗體。細胞核蛋白分別加入p-p65抗體，選擇PCNA抗體作為內(nèi)參抗體。一抗在4 ℃下孵育過夜，TBST洗脫后，加入生物素化二抗在室溫下孵育2 h，ECL顯色并進行成像分析。

2 結(jié) 果

2.1 萊菔硫烷可改善缺血再灌注小鼠腎功能生化檢測結(jié)果表明，與Ctrl組血肌酐[(50.41±6.19)μmol/L]和尿素氮[(38.40±11.55)μmol/L]水平相比，缺血再灌注組小鼠血肌酐水平升高[(108.01±27.96)μmol/L，P=0.007]、尿素氮水平升高[(106.00±12.35)μmol/L，P=0.002]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而萊菔硫烷干預(yù)缺血再灌注小鼠后血肌酐水平降低到(87.01±10.98)μmol/L(P=0.016)，尿素氮水平降低到(76.60±14.23)μmol/L(P=0.008)，這提示萊菔硫烷可改善缺血再灌注損傷引起的小鼠腎功能。正常小鼠單獨使用萊菔硫烷后，血肌酐和尿素氮水平并未升高(圖2)。

圖2 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠的腎功能檢測

Fig.2 Renal function test after intervention by sulforaphane

A：血肌酐；B：血尿素氮。與Ctrl組比較，#P<0.05。與IRI組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 萊菔硫烷可改善小鼠腎缺血再灌注損傷并減少腎小管上皮細胞凋亡TUNEL染色及其對應(yīng)的凋亡指數(shù)也表明，與IRI組相比，IRI+SFN組和SFN組的小鼠腎臟發(fā)生凋亡的腎小管上皮細胞數(shù)量減少(圖3A)?；赥UNEL染色的分析顯示IRI組的凋亡指數(shù)是(51.67±7.63)%，而IRI+SFN組小鼠腎組織的凋亡指數(shù)降到了(12.33±2.52)%(P=0.018)，SFN組小鼠腎組織中凋亡指數(shù)下降到(2.33±1.52)%(P=0.023，圖3B)。HE染色結(jié)果顯示，IRI組小鼠腎小管發(fā)生明顯擴張，間質(zhì)水腫，刷狀緣明顯脫落，腎小管上皮細胞發(fā)生空泡變性和死亡。而萊菔硫烷干預(yù)后，缺血再灌注損傷引起的小鼠腎小管擴張減輕，腎小管上皮細胞空泡變性減輕，凋亡減少，刷狀緣脫落明顯減少(圖3C)。

2.3 萊菔硫烷可降低缺血再灌注損傷小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平ELISA檢測結(jié)果顯示，與Ctrl組比較，IRI組小鼠血清中TNF-α增至(506.20±148.93)pg/mL(P=0.003)、IL-1β增至(454.50±122.39)pg/mL(P=0.002)，IL-6的分泌量增至(243.20±87.78)pg/mL(P=0.005)，而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后，小鼠血清中TNF-α降至(212.41±132.56)pg/mL(P=0.001)、IL-1β降至(189.03±75.18)pg/mL(P=0.003)，IL-6的分泌量降至(131.40±44.98)pg/mL(P=0.004)。且單獨使用萊菔硫烷組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平較Ctrl組未見明顯的增高(P>0.05，圖4)。

2.4 萊菔硫烷增加缺血再灌注損傷小鼠腎組織中Nrf-2的表達Western blot檢測小鼠腎組織總蛋白結(jié)果顯示，與Ctrl組比較，IRI組小鼠腎組織中Nrf-2的表達量減少(P=0.002)；而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后，小鼠腎組織中Nrf-2的表達量增加(P<0.001)。與Ctrl組比較，IRI組小鼠腎組織中Keap-1的表達量未見降低(P>0.05)，而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后，小鼠腎組織中Keap-1的表達量也未見降低(P>0.05，圖5)。

2.5 萊菔硫烷減少缺血再灌注損傷小鼠腎組織中p-iκBα和胞核內(nèi)p-p65的表達Western blot檢測小鼠腎組織總蛋白的結(jié)果顯示，與Ctrl組比較，IRI組小鼠腎組織中p-iκBα的表達量增多(P<0.001)，而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷的小鼠后腎組織中p-iκBα的表達量降低(P=0.003)。Western blot檢測小鼠腎組織細胞核蛋白的結(jié)果顯示，與Ctrl組比較，IRI組小鼠腎組織中p-p65的表達量增多(P=0.004)，而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷小鼠后腎組織中p-p65的表達量降低(P=0.001，圖6)。

3 討 論

腎缺血再灌注損傷的發(fā)病機制涉及氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。來源于十字花科植物的萊菔硫烷具有較好的抗氧化應(yīng)激作用[9]，但其對腎缺血再灌注損傷的作用與機制尚不完全清楚。本研究觀察到IRI組小鼠血肌酐和尿素氮水平均升高，而萊菔硫烷干預(yù)缺血再灌注小鼠以后血清血肌酐和尿素氮水平降低。IRI組小鼠腎小管發(fā)生擴張，腎小管上皮細胞發(fā)生空泡變性和死亡，刷狀緣明顯脫落。而萊菔硫烷干預(yù)后，缺血再灌注損傷引起的小鼠腎小管擴張減輕，腎小管上皮細胞空泡變性減輕，死亡減少，刷狀緣脫落明顯減少。IRI+SFN組的小鼠腎臟中發(fā)生凋亡的腎小管上皮細胞數(shù)量明顯減少，這些結(jié)果都提示出萊菔硫烷可改善缺血再灌注損傷引起的小鼠腎損傷。

圖3 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠的病理檢測

Fig.3 Pathologic detection of sulforaphane after intervention in mice

A：TUNEL染色；B：基于TUNEL染色的凋亡指數(shù)；C：HE染色(×200)。與IRI組比較，*P<0.05。

圖4 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠血清中炎癥因子水平的變化

Fig.4 Changes of inflammatory factors in serum of mice after intervention with sulforaphane

與Ctrl組比較，#P<0.05。與IRI組比較，*P<0.05。

圖5 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠腎組織中Nrf-2和Keap-1的Western blot檢測

Fig.5 Western blot detection of Nrf-2 and Keap-1 in renal tissues of mice after intervention with sulforaphane

A：Western blot檢測結(jié)果；B：Nrf-2/GAPDH的吸光度分析；C：Keap-1/GAPDH的吸光度分析。與Ctrl組比較，#P<0.05。與IRI組比較，*P<0.05。

圖6 萊菔硫烷干預(yù)后小鼠腎組織中總蛋白的Western blot檢測

Fig.6 Western blot of kidney tissue of mice after intervention with sulforaphane

A：Western blot檢測小鼠腎組織總蛋白中p-iκBα和iκBα表達；B：p-iκBα/iκBα的吸光度分析；C：Western blot檢測小鼠腎組織核蛋白中p-p65和PCNA表達；D：p-p65/PCNA的吸光度分析。與Ctrl組比較，#P<0.05。與IRI組比較，*P<0.05，**P<0.01。

萊菔硫烷具有抗氧化應(yīng)激的功能，抗氧化應(yīng)激的作用主要通過影響Nrf-2信號通路來實現(xiàn)[10]。Nrf-2已經(jīng)被證實在多種疾病中具有抗氧化應(yīng)激從而保護機體的作用[11-13]。萊菔硫烷直接作用于Keap-1上的巰基而破壞Nrf-2-Keap-1復(fù)合體，或者激活MAPK信號通路使Keap-1發(fā)生磷酸化，最終導(dǎo)致Nrf-2從復(fù)合體中被釋放出來，Nrf-2即可被激活而具有活性，然后發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)位，結(jié)合到ARE元件，參與轉(zhuǎn)錄激活Ⅱ相酶基因。醌氧化還原酶(NQO1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)等Ⅱ相酶在機體內(nèi)均具有很好的解毒作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，IRI組小鼠腎組織中Nrf-2的表達量減少，而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后，小鼠腎組織中Nrf-2的表達量增加。IRI組小鼠腎組織中Keap-1的表達量未見降低，萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后，小鼠腎組織中Keap-1的表達量也未見降低。由此提示萊菔硫烷改善小鼠腎缺血再灌注損傷可能是通過影響Nrf-2相關(guān)信號而非Keap-1來實現(xiàn)的。

萊菔硫烷還具有潛在的抗炎作用。LIN等[16]報道萊菔硫烷可以通過Nrf-2途徑抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應(yīng)。HEISS等[17]報道NFκB是萊菔硫烷調(diào)控抗炎作用的分子靶點。SUN等[18]也在肌營養(yǎng)不良的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷可通過Nrf-2抑制NFκB而減弱肌肉的炎癥。本研究觀察到IRI組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量增多，而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后，小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量降低。且單獨使用萊菔硫烷組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量較于Ctrl組小鼠未見明顯的增多。當(dāng)炎癥活躍時iκBα發(fā)生磷酸化，NFκB p65與iκBα發(fā)生解離，NFκB p65繼而發(fā)生磷酸化轉(zhuǎn)位進入細胞核啟動下游炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表達。我們在研究中發(fā)現(xiàn)IRI組小鼠腎組織中p-iκBα的表達量增多，而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后，小鼠腎組織中p-iκBα的表達量降低。IRI組小鼠腎組織中p-p65的表達量增多，而萊菔硫烷治療腎缺血再灌注損傷以后，小鼠腎組織中p-p65的表達量降低。該結(jié)果提示萊菔硫烷可以抑制iκBα發(fā)生磷酸化， 進而抑制NFκB p65的磷酸化轉(zhuǎn)位進入細胞核并阻止其啟動下游炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的表達，最終達到抗缺血再灌注損傷所致炎癥的作用。我們將在萊菔硫烷對 Nrf-2介導(dǎo)的NFκB通路調(diào)控方面進行深入研究，為萊菔硫烷的臨床應(yīng)用前景打下基礎(chǔ)。