劉宏果，張之奎

(石家莊鵬海制藥股份有限公司，河北 050600)

維格列汀(vildagliptin)是諾華制藥公司開發(fā)的一種口服抗糖尿病新藥，屬于二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑，于2007年9月在歐盟批準(zhǔn)上市，2011年8月CFDA批準(zhǔn)其制劑在我國上市?；瘜W(xué)名稱為1-{[(3-羥基-1-金剛烷基)氨基]乙?；鶀-2-氰基-(S)-四氫吡咯烷[1，2]，結(jié)構(gòu)式見圖1。由圖1看出，該藥分子中含有手性中心，目前R型異構(gòu)體的檢測方法未見報(bào)道，本研究工作使用高效液相色譜法，采用外標(biāo)法對維格列汀中R型異構(gòu)體含量進(jìn)行檢測，研究其檢測條件，建立了一種可靠的檢測方法。

1 儀器與試藥

LC-10A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；AUW120D型分析天平(日本島津公司)；Chiralpak IC(250 mm×4.6 mm，5 μm)手性色譜柱。維格列汀R型異構(gòu)體對照品(批號DZ141001，純度99%)、維格列汀對照品(批號DZ141101，純度99%)、維格列汀(批號14110，1141102，141103)均由石家莊康賀威藥業(yè)有限公司提供；乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、正己烷(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、叔丁基胺(北京百靈威科技有限公司)均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Chiralpak IC(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶10.1)；流速：0.7 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣體積：10 μl。

2.2溶液制備

2.2.1供試品溶液 取本品20 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2對照品溶液 取維格列汀R型異構(gòu)體對照品約10 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為維格列汀R型異構(gòu)體對照品儲備液；再精密量取1.00 ml置100 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性溶液 取維格列汀對照品200 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，精密加入1 ml異構(gòu)體對照品儲備液，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取空白溶劑、對照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液和供試品溶液各10 μl,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果空白溶劑在維格列汀及R型異構(gòu)體出峰位置不出峰，空白溶劑不干擾R型異構(gòu)體的測定；系統(tǒng)適用性溶液中維格列汀與其R型異構(gòu)體的分離度大于1.6，維格列汀峰的理論塔板數(shù)大于2 000。見圖2。

1.維格列汀異構(gòu)體 2.維格列汀

2.4線性試驗(yàn) 精密稱取維格列汀R異構(gòu)體對照品適量，加流動相溶解并稀釋成含異構(gòu)體0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 μg/ml的溶液，分別進(jìn)樣10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以維格列汀R型異構(gòu)體濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，線性方程為Y=8 882.4X-1 103.4(r=0.999 4)。結(jié)果表明維格列汀R型異構(gòu)體在濃度0.4～2.4 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5檢測限 精密量取維格列汀R型異構(gòu)體對照品儲備液逐級稀釋至信噪比(S/N)約為3時(shí)，計(jì)算檢測限為1.3 ng。

2.6定量限 精密量取R型異構(gòu)體對照品儲備液逐級稀釋至信噪比(S/N)約為10時(shí)，計(jì)算定量限為4.0 ng。

2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品6份，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果均未檢出異構(gòu)體，本法測定維格列汀中異構(gòu)體重復(fù)性良好。

2.8精密度試驗(yàn) 取異構(gòu)體對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD為1.4%，符合規(guī)定，說明本法測定維格列汀中異構(gòu)體精密度良好。

2.9溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 室溫條件下分別于0、2、4、6、8、10和14 h進(jìn)樣，對照品和回收率試驗(yàn)溶液中異構(gòu)體峰面積的RSD分別為1.0%和1.1%，均小于2%，溶液穩(wěn)定性良好。

2.10回收率試驗(yàn) 制備限度濃度的異構(gòu)體溶液80%、100%和120%的9份不含維格列汀異構(gòu)體的維格列汀樣品加標(biāo)溶液進(jìn)行評價(jià)(每個(gè)濃度3份)，結(jié)果維格列汀異構(gòu)體的平均回收率為97.1%，RSD為2.2%(n=9)，說明該方法準(zhǔn)確度較高。見表1。

表1 維格列汀異構(gòu)體回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.11樣品檢測 取批號為141101、141102和141103的3批維格列汀原料藥，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，外標(biāo)法計(jì)算異構(gòu)體含量。3批樣品均未檢出其R型異構(gòu)體。

2.12穩(wěn)定性試驗(yàn) 將三批維格列汀原料置加速(溫度40 ℃，濕度75%)及長期穩(wěn)定性試驗(yàn)箱(溫度25 ℃，濕度60%)放置，于加速1月、加速2月、加速3月、加速6月、長期3月和長期6月取樣進(jìn)行檢測，均未檢出異構(gòu)體，說明維格列汀質(zhì)量穩(wěn)定。

3 討論

3.1流動相的選擇 由于維格列汀為堿性樣品，在試驗(yàn)過程中優(yōu)先考慮采用流動相乙醇-二乙胺(100∶0.2)，配制1 mg/ml維格列汀及其R型異構(gòu)體的混合溶液，二者分離度只有1.3，調(diào)整流動相比例為乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.2)，維格列汀出峰時(shí)間合適，但色譜峰峰高只有50，達(dá)不到靈敏度檢測要求。考慮微調(diào)流動相，改為乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.1)和乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.3)配制系統(tǒng)適用性溶液，分別進(jìn)樣，流動相為乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.1)的維格列汀峰高明顯比流動相為乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.3)的峰高高。所以選擇乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.1)為流動相。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中異構(gòu)體與維格列汀峰分離良好，分離度達(dá)到2.3，異構(gòu)體峰在限度濃度下檢出明顯，能達(dá)到靈敏度檢測要求。見圖3和圖4。

1.維格列汀R型異構(gòu)體 2.維格列汀

1.維格列汀R異構(gòu)體 2.維格列汀

3.2檢測波長的選擇 取維格列汀對照品溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，維格列汀在196 nm有最大吸收，考慮到流動相的紫外截止波長，將檢測波長確定為210 nm。

3.3柱溫的選擇 精密量取系統(tǒng)適用性溶液分別于柱溫25和30 ℃注入液相色譜儀，記錄色譜圖。維格列汀與其R型異構(gòu)體的分離度分別為2.3和1.8，均符合要求，最終將柱溫確定為25 ℃。

采用高效液相色譜法測定維格列汀中R型異構(gòu)體含量，色譜柱為Chiralpak IC(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙醇-正己烷-叔丁基胺(90∶10∶0.1)；流速為0.7 ml/min；柱溫為25 ℃；檢測波長210 nm。維格列汀與其R型異構(gòu)體峰分離良好，異構(gòu)體在0.4～2.4 μg/ml范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，異構(gòu)體的定量限為4.0 ng，檢測限為1.3 ng。該方法簡便易行，靈敏度高，可用于維格列汀R型異構(gòu)體含量的檢測。